[發(fā)明專利]藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法

無效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010201826.6
• 申請(qǐng)日: 2010-06-12
• 公開（公告）號(hào): CN101870962A
• 公開（公告）日: 2010-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙新全;于鴻浩;郭志林;郭松長;曹俊虎;徐世曉
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院西北高原生物研究所
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071;C12R1/91
• 代理公司: 蘭州中科華西專利代理有限公司 62002
• 代理人: 李艷華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)，尤其涉及藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

藏羚羊(Pantholops?hodgsoni)隸屬于偶蹄目牛科山羊亞科藏羚屬，青藏高原特有物種，屬國家一級(jí)保護(hù)動(dòng)物和《瀕危野生動(dòng)植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)中嚴(yán)禁進(jìn)行貿(mào)易活動(dòng)的瀕危動(dòng)物，主要分布在中國境內(nèi)的青海、西藏、新疆三省的高寒荒漠化草原、高寒草原和高寒草甸地區(qū)，平均生活在海拔4100～5500m之間惡劣的環(huán)境中。由于環(huán)境因素導(dǎo)致深入研究藏羚羊存在著很大困難，目前關(guān)于藏羚羊的研究主要以宏觀動(dòng)物學(xué)研究為主，包括：動(dòng)物行為、種群分布、個(gè)體生物學(xué)、系統(tǒng)發(fā)生學(xué)、寄生蟲、疾病的診斷和治療、羊絨的物理和化學(xué)性質(zhì)等。關(guān)于藏羚羊分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的研究較少。鑒于此，建立藏羚羊細(xì)胞系以解決研究材料的問題十分必要。

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)是生命科學(xué)研究領(lǐng)域的重要研究技術(shù)。現(xiàn)代生物技術(shù)中無論是基因治療、干細(xì)胞、動(dòng)物克隆都以細(xì)胞為載體進(jìn)行。細(xì)胞的生長需要一定的營養(yǎng)環(huán)境，用于維持細(xì)胞生長的營養(yǎng)基質(zhì)稱為培養(yǎng)基。目前商品化的常用培養(yǎng)基包括MEM培養(yǎng)基系列、DMEM培養(yǎng)基系列、RPMI-1640培養(yǎng)基系列、199培養(yǎng)基系列、水解乳蛋白細(xì)胞培養(yǎng)基、F10、F12細(xì)胞培養(yǎng)基系列等。在眾多培養(yǎng)基中，哪種培養(yǎng)基可以培養(yǎng)藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞以及建立藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞系的具體方法沒有詳細(xì)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種獲得藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞、為開展藏羚羊分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)的相關(guān)研究提供研究材料的藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法。

為解決上述問題，本發(fā)明所述的一種藏羚羊皮膚成纖維細(xì)胞系的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

(1)采樣：從雌性成年藏羚羊個(gè)體的耳部取1cm²皮膚組織，并將其放入裝有貯存液的離心管中；

(2)藏羚羊耳部皮膚組織原代培養(yǎng)：將所述步驟(1)所得的藏羚羊耳部皮膚組織依次經(jīng)含有雙抗的杜氏磷酸緩沖液(D-PBS)浸洗、含有雙抗的D/F12培養(yǎng)液沖洗后，將樣本組織塊放入35mm培養(yǎng)皿中，剪碎；然后用吸管將碎組織塊移入預(yù)先用胎牛血清涂布的培養(yǎng)瓶中，均勻地?cái)[放于培養(yǎng)瓶底部；最后將培養(yǎng)瓶倒置放在飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱中，3h后翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，加入3～5mL?D/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)10～18天，得到生長至80％～90％匯合的原代細(xì)胞；

(3)傳代與純化：將所述步驟(2)所得的原代細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)；首先將原代細(xì)胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗，再用1～2mL含0.05％胰蛋白酶和0.01％乙二胺四乙酸(EDTA)的混合液消化，得到消化液A；然后將所述消化液A放入飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱2～3min，取出，加入與消化液A等量的D/F12培養(yǎng)液終止消化，得到消化液B；將所述消化液B經(jīng)離心、去上清液后，得到細(xì)胞沉淀物A；用D/F12培養(yǎng)液將所述細(xì)胞沉淀物A傳入另一個(gè)培養(yǎng)瓶中，在37.5℃、含5％CO₂的飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)3～6天，得到生長至80％～90％匯合的皮膚成纖維細(xì)胞；

(4)細(xì)胞凍存：將所述步驟(3)所得的皮膚成纖維細(xì)胞用1～2mL含0.05％胰蛋白酶和0.01％乙二胺四乙酸(EDTA)的混合液消化，離心后加入細(xì)胞凍存液混勻，先在4℃保存半小時(shí)，然后在-70℃冰箱中過夜，最后直接投入液氮保存，得到凍存皮膚成纖維細(xì)胞；

(5)細(xì)胞復(fù)蘇：將所述步驟(4)所得的凍存皮膚成纖維細(xì)胞放入37℃水浴中融化，吸出細(xì)胞懸液，用9倍所述細(xì)胞懸液體積的D/F12培養(yǎng)液進(jìn)行洗滌，經(jīng)離心、去上清后，得到細(xì)胞沉淀物B；用D/F12培養(yǎng)液充分懸浮細(xì)胞沉淀物B，并接種于培養(yǎng)瓶中，置于飽和濕度二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)即可。

所述步驟(1)中的貯存液為加入雙抗的T20；所述加入雙抗的T20是由占總?cè)芤后w積的20％的胎牛血清(FBS)和80％的含10mM羥乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基礎(chǔ)培養(yǎng)液組成，并在配置后加入雙抗，然后用NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4的溶液。