[發明專利]藏羚羊皮膚成纖維細胞系的構建方法

無效

• 申請號: 201010201826.6
• 申請日: 2010-06-12
• 公開（公告）號: CN101870962A
• 公開（公告）日: 2010-10-27
• 發明（設計）人: 趙新全;于鴻浩;郭志林;郭松長;曹俊虎;徐世曉
• 申請（專利權）人: 中國科學院西北高原生物研究所
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12R1/91
• 代理公司: 蘭州中科華西專利代理有限公司 62002
• 代理人: 李艷華

1.一種藏羚羊皮膚成纖維細胞系的構建方法，包括以下步驟：

(1)采樣：從雌性成年藏羚羊個體的耳部取1cm²皮膚組織，并將其放入裝有貯存液的離心管中；

(2)藏羚羊耳部皮膚組織原代培養：將所述步驟(1)所得的藏羚羊耳部皮膚組織依次經含有雙抗的杜氏磷酸緩沖液浸洗、含有雙抗的D/F12培養液沖洗后，將樣本組織塊放入35mm培養皿中，剪碎；然后用吸管將碎組織塊移入預先用胎牛血清涂布的培養瓶中，均勻地擺放于培養瓶底部；最后將培養瓶倒置放在飽和濕度二氧化碳培養箱中，3h后翻轉培養瓶，加入3～5mL?D/F12培養液繼續培養10～18天，得到生長至80％～90％匯合的原代細胞；

(3)傳代與純化：將所述步驟(2)所得的原代細胞進行傳代培養；首先將原代細胞用磷酸鹽緩沖液清洗，再用1～2mL含0.05％胰蛋白酶和0.01％乙二胺四乙酸的混合液消化，得到消化液A；然后將所述消化液A放入飽和濕度二氧化碳培養箱2～3min，取出，加入與消化液A等量的D/F12培養液終止消化，得到消化液B；將所述消化液B經離心、去上清液后，得到細胞沉淀物A；用D/F12培養液將所述細胞沉淀物A傳入另一個培養瓶中，在37.5℃、含5％CO₂的飽和濕度二氧化碳培養箱中繼續培養3～6天，得到生長至80％～90％匯合的皮膚成纖維細胞；

(4)細胞凍存：將所述步驟(3)所得的皮膚成纖維細胞用1～2mL含0.05％胰蛋白酶和0.01％乙二胺四乙酸的混合液消化，離心后加入細胞凍存液混勻，先在4℃保存半小時，然后在-70℃冰箱中過夜，最后直接投入液氮保存，得到凍存皮膚成纖維細胞；

(5)細胞復蘇：將所述步驟(4)所得的凍存皮膚成纖維細胞放入37℃水浴中融化，吸出細胞懸液，用9倍所述細胞懸液體積的D/F12培養液進行洗滌，經離心、去上清后，得到細胞沉淀物B；用D/F12培養液充分懸浮細胞沉淀物B，并接種于培養瓶中，置于飽和濕度二氧化碳培養箱中培養即可。

2.如權利要求1所述的藏羚羊皮膚成纖維細胞系的構建方法，其特征在于：所述步驟(1)中的貯存液為加入雙抗的T20；所述加入雙抗的T20是由占總溶液體積的20％的胎牛血清和80％的含10mM羥乙基哌嗪乙磺酸的TCM199基礎培養液組成，并在配置后加入雙抗，然后用NaOH調節pH值至7.2～7.4的溶液。

3.如權利要求1所述的藏羚羊皮膚成纖維細胞系的構建方法，其特征在于：所述步驟(2)中的杜氏磷酸緩沖液是由0.8g/100mL的NaCl、0.0203g/100mL的KCl、0.1152g/100mL的Na₂HPO₄、0.0203g/100mL的KH₂PO₄、0.0134g/100mL的CaCl₂·2H₂O、0.01g/100mL的MgCl₂·6H₂O、0.0036g/100mL的丙酮酸鈉、0.0075g/100mL的青霉素、0.005g/100mL的鏈霉素和0.1g/100mL的葡萄糖組成。

4.如權利要求1所述的藏羚羊皮膚成纖維細胞系的構建方法，其特征在于：所述步驟(2)、(3)和(5)中的D/F12培養液均是由占總培養液體積的10％的胎牛血清、90％的D/F12和雙抗組成。

5.如權利要求1所述的藏羚羊皮膚成纖維細胞系的構建方法，其特征在于：所述步驟(3)中的磷酸鹽緩沖液是由0.8g/100mL的NaCl、0.02g/100mL的KCl、0.115g/100mL的Na₂HPO₄和0.02g/100mL的KH₂PO₄組成。

6.如權利要求1所述的藏羚羊皮膚成纖維細胞系的構建方法，其特征在于：所述步驟(4)中的凍存液是由占總溶液體積的20％的胎牛血清、10％的二甲基亞砜、70％的D/F12和雙抗組成。

7.如權利要求1所述的藏羚羊皮膚成纖維細胞系的構建方法，其特征在于：所述步驟(2)、(3)和(5)中的飽和濕度二氧化碳培養箱是指溫度為37.5℃、含5％CO₂的飽和濕度空氣的二氧化碳培養箱。

8.如權利要求1所述的藏羚羊皮膚成纖維細胞系的構建方法，其特征在于：所述雙抗是指75μg/mL的青霉素和100μg/mL的鏈霉素。