[發明專利]一種Ⅳ型膠原酶含量測定方法

無效

• 申請號: 201010201541.2
• 申請日: 2010-06-17
• 公開（公告）號: CN101846632A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 凌青;余謹;趙云斌
• 申請（專利權）人: 華中科技大學
• 主分類號: G01N21/78
• 分類號: G01N21/78
• 代理公司: 北京市德權律師事務所 11302
• 代理人: 周發軍

技術領域

本發明涉及一種測定人體血漿、血清中Ⅳ型膠原酶含量的測定方法。

背景技術

Ⅳ型膠原酶是生物體內重要的基質金屬蛋白酶，又稱基底膜性膠原酶，在細胞遷移、創傷修復、惡性腫瘤的浸潤與轉移等過程中發揮重要的病理生理作用。目前研究表明，血漿Ⅳ型膠原酶含量的異常增高常與心臟衰竭、肺氣腫、自身免疫性疾病、腫瘤生長及腫瘤細胞的侵襲和轉移等重大疾病密切相關。為了更廣泛的研究Ⅳ型膠原酶的病理生理作用，建立快捷、精確、低成本、高通量的檢測方法具有重要意義。

目前檢測血漿Ⅳ型膠原酶活性的方法主要有3種：底物膠電泳酶譜法、ELISA和HPLC。底物膠電泳酶譜法分析時間長達數天，分析步驟復雜。ELISA法雖具有特異性、靈敏度高的優勢，但所需標記抗體成本高，試劑盒昂貴，測定出的酶含量不能表現出酶的生物學活性，同時分析速度慢。HPLC雖具有分析速度快，定量準確等優點，但方法特異性差，不能進行大樣本同時檢測，難以滿足臨床檢測要求。

發明內容

本發明的目的是解決上述問題而提供了一種Ⅳ型膠原酶含量測定方法，利用該方法可以準確、快速的測定到人體血漿或血清中Ⅳ型膠原酶的含量。

本發明所采用的技術方案是：

一種Ⅳ型膠原酶含量測定方法，包括以下步驟：

a）分別準備空白管、標準管和待測樣品管；首先向空白管、標準管和待測樣品加入底物溶液，所述底物溶液為5mg/ml～10mg/ml琥珀酰明膠；接著向空白管中加入樣品稀釋液，向標準管中加入標準品，向待測樣品管中加入待測樣品，所述樣品稀釋液為體積百分比為40mmol/l～60mmol/lTris緩沖液、5mmol/l～15mmol/lCaCl₂、10μmol/l～20μmol/lZnCl₂以及質量百分數為0.05%～0.1%月桂醇聚氧乙烯醚混合而成，所述標準品為已知濃度的Ⅳ型膠原酶；最后向標準管和待測樣品管中加入樣品稀釋液，在35^oC～45^oC水浴反應30～120分鐘；

b）在空白管、標準管和待測樣品管中加入終止液終止酶切反應，再加入檢測溶液A和檢測溶液B，最后加入檢測稀釋液，在35^oC～45^oC水浴下顯色反應30～60分鐘，使其顯色反應充分進行，所述終止液為質量百分數為0.05%～0.2%HCL,檢測溶液A為0.1M～0.5MNaOH，檢測溶液B為質量百分數為0.01%～0.05%三硝基苯磺酸，檢測稀釋液為雙蒸水；

c）各管冷卻至室溫后，取各管溶液至酶標板中，用酶標儀測定吸光度;

d）以標準物的濃度為橫坐標，測定出的吸光度值為縱坐標，繪制出標準曲線，根據待測樣品的吸光度值在標準曲線上查出相應的待測樣品的Ⅳ型膠原酶含量；或者用標準物的濃度與吸光度值算出標準曲線的方程，將待測樣品的吸光度值代入方程，計算出待測樣品的Ⅳ型膠原酶含量。

優選地，所述標準管的數量至少為六個。

進一步地，所述待測樣品為血清或血漿。

優選地，所述酶標儀在400nm～440nm處測定吸光度。

本發明具有以下優點：

本發明利用Ⅳ型膠原酶具有水解明膠的特異性結合位點，而血漿中存在的其它基質金屬蛋白酶難以水解明膠，采用TNBS對明膠的水解產物進行顯色，可以對人體血漿和血清中的Ⅳ型膠原酶進行特異性的定量分析。該測定方法以琥珀酰明膠作為酶切底物，采用TNBS顯色劑對酶切產生的末端氨基顯色，TNBS與末端氨基結合的情況下顏色變黃，顏色的深淺和樣品中的Ⅳ型膠原酶含量呈正相關。用酶標儀在特定波長下測定吸光度，計算樣品濃度。本方法可以快速、準確的測定出人體血漿或血清中Ⅳ型膠原酶的含量，且測量結果直接體現出血漿當中具有活性意義的Ⅳ型膠原酶含量，無需再進一步檢測抑制物的含量。

附圖說明

圖1為實施例1Ⅳ型膠原酶的標準曲線；

圖2為健康人血漿Ⅳ型膠原酶含量分布圖。

具體實施方式

實施例1：本實施例來測定一個血清樣本的Ⅳ型膠原酶含量。首先對待測血樣進行處理，將全血標本2500轉離心5分鐘，取上清即可檢測，或將標本放于-20℃或-80℃保存，但應避免反復凍融。需要注意的是：血清在檢測前應稀釋8倍再做檢測，在置4℃保存應小于1周，-20℃或-80℃均應密封保存，-20℃或-80℃不應超過1個月，標本溶血會影響最后檢測結果，因此溶血標本不宜進行此項檢測。