[發(fā)明專利]昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)酸性海藻糖酶基因菌株及制備方法和用途

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010200520.9
• 申請(qǐng)日: 2010-06-13
• 公開（公告）號(hào): CN101886046A
• 公開（公告）日: 2010-11-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 夏玉先;彭國(guó)雄
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 重慶大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/15
• 分類號(hào): C12N1/15;C12N15/56;C12N15/63;A01N63/04;A01P7/04;C12R1/645;C12R1/79
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責(zé)任公司 50209
• 代理人: 周韶紅

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因菌株及其制備方法和用途，尤其涉及昆蟲病原真菌轉(zhuǎn)基因菌株及其制備方法和用途。

背景技術(shù)

害蟲防治是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要組成部分。化學(xué)農(nóng)藥在防治有害生物和保障農(nóng)業(yè)增產(chǎn)方面起了積極作用。但化學(xué)農(nóng)藥大量長(zhǎng)期使用引起了一系列的環(huán)境和食品安全問題。由于微生物生物防治具有安全和可持續(xù)控制的優(yōu)點(diǎn)，一直受到人們的廣泛關(guān)注。其中，昆蟲病原真菌是昆蟲病原微生物中最大的一個(gè)類群，自然死亡昆蟲的60％由其引起，是自然界控制昆蟲種群數(shù)量的重要因素之一。昆蟲病原真菌主要通過體壁侵染昆蟲，在害蟲持續(xù)控制及維護(hù)物種多樣性方面具有特殊優(yōu)勢(shì)。目前真菌殺蟲劑已作為化學(xué)農(nóng)藥的替代產(chǎn)品或補(bǔ)充制劑防治多種有害昆蟲。然而，與其他微生物農(nóng)藥一樣，真菌農(nóng)藥存在殺蟲較慢、防效不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，這極大限制了其廣泛應(yīng)用。提高昆蟲病原真菌殺蟲速度對(duì)擴(kuò)大其應(yīng)用范圍、減少化學(xué)農(nóng)藥使用、保護(hù)生態(tài)環(huán)境具有重要意義。

提高昆蟲病原真菌殺蟲劑殺蟲速度措施主要有：(1)通過制劑研究為真菌提供適宜的微環(huán)境，促進(jìn)真菌快速生長(zhǎng)與侵染；(2)通過菌株篩選獲得高殺蟲活性的菌株；(3)通過菌株改良獲得高殺蟲活性的菌株。殺蟲真菌制劑研究成果對(duì)促進(jìn)殺蟲真菌產(chǎn)業(yè)化與應(yīng)用起到推動(dòng)作用，特別是殺蟲真菌油懸浮劑的出現(xiàn)，顯著降低殺蟲真菌環(huán)境濕度依耐性，使得殺蟲真菌應(yīng)用范圍從森林等蔭蔽區(qū)域擴(kuò)大到干旱、高溫區(qū)域。但是，由于昆蟲病原真菌侵染昆蟲是兩者相互作用的過程，即便在適宜的環(huán)境條件下，真菌侵染昆蟲直至昆蟲死亡，仍需要較長(zhǎng)的時(shí)間。通過菌株篩選已獲得針對(duì)多種不同昆蟲的一系列具有高殺蟲活性的昆蟲病原真菌菌株，其中國(guó)內(nèi)外登記注冊(cè)的真菌農(nóng)藥已有100多種，由于自然菌株是經(jīng)過長(zhǎng)期與寄主昆蟲相互作用進(jìn)化形成，與寄主昆蟲在自然界中達(dá)到平衡，所以從大量菌株篩選具有高殺蟲活性的昆蟲病原真菌菌株費(fèi)時(shí)、費(fèi)事。目前，在昆蟲病原真菌致病機(jī)制研究的基礎(chǔ)上利用基因工程手段改良菌株成為提高昆蟲病原真菌殺蟲活性的重要途徑。

昆蟲病原真菌侵染寄主昆蟲主要有3個(gè)過程：①分生孢子附著在寄主表皮；②穿透昆蟲表皮入侵到昆蟲體內(nèi)；③在昆蟲體內(nèi)利用昆蟲營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)繁殖并分泌毒素直至昆蟲得病死亡。迄今為止，對(duì)昆蟲病原真菌致病機(jī)制的研究成果主要集中在真菌穿透寄主表皮過程中產(chǎn)生的一些水解酶類，并分離鑒定多個(gè)與致病相關(guān)的基因，如蛋白酶Prl、幾丁質(zhì)酶等。St?Leger(1996)通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)成功的將Prl基因轉(zhuǎn)入綠僵菌(Metarhizium)，獲得高毒力的綠僵菌工程菌株。該工程菌株在煙草天蛾的血淋巴中組成性超表達(dá)后激活酚氧化酶系統(tǒng)，引起幼蟲黑化，導(dǎo)致昆蟲死亡時(shí)間縮短25％，取食量下降40％。2005年Fang等人成功將昆蟲病原真菌毒力因子-幾丁質(zhì)水解酶Bbchitl基因構(gòu)建在gpd組成性啟動(dòng)子下游轉(zhuǎn)入白僵菌基因組中，獲得超表達(dá)工程菌株。工程菌株對(duì)蚜蟲的毒力明顯增強(qiáng)：與野生菌株相比，工程菌株對(duì)蚜蟲的致死劑量降低50％，致死時(shí)間縮短50％。Fang等人(2007)將家蠶的BmChBD融合到Bbchitl中獲得的雜交幾丁水解酶，這個(gè)雜交幾丁水解酶(Bbchitl-BmChBD)的基因與組成性啟動(dòng)子gpd(三磷酸甘油醛脫氫酶)連接后被成功轉(zhuǎn)化到白僵菌中，提高真菌的表皮穿透能力，與野生菌株相比，工程菌株使昆蟲死亡時(shí)間縮短23％。

然而，由于研究難度較大，目前對(duì)病原真菌進(jìn)入昆蟲血腔后到寄主死亡前的時(shí)期(侵入后)研究較少，而這一時(shí)期又恰是病原真菌與寄主之間生死斗爭(zhēng)的關(guān)鍵時(shí)期，占了真菌侵染致病過程中絕大部分時(shí)間，縮短病原真菌昆蟲體內(nèi)侵染時(shí)間能有效提高昆蟲病原真菌殺蟲活性。Wang?and?St.Leger(2007)通過基因工程的方法將一種昆蟲特異性神經(jīng)毒素(來源于黃肥尾蝎)基因AajIT轉(zhuǎn)入綠僵菌，使其侵染寄主昆蟲后在昆蟲血淋巴中特異表達(dá)；當(dāng)死亡率相同時(shí)，該工程菌株防治煙草天蛾的劑量比野生型菌株降低22倍，縮短防治埃及伊蚊時(shí)間40％以上；該工程菌株防治咖啡豆蛀蟲的劑量較野生型菌株降低15.7倍(Pava-Ripoll等，2008)。Thomas?and?Read(2007)認(rèn)為：由于社會(huì)心理和政治的因素，該方法被廣泛應(yīng)用還需一個(gè)較長(zhǎng)時(shí)間。采用安全、易被人們接受的基因工程菌縮短病原真菌昆蟲體內(nèi)侵染時(shí)間成為研究熱點(diǎn)。