[發明專利]昆蟲病原真菌轉酸性海藻糖酶基因菌株及制備方法和用途

有效

• 申請號: 201010200520.9
• 申請日: 2010-06-13
• 公開（公告）號: CN101886046A
• 公開（公告）日: 2010-11-17
• 發明（設計）人: 夏玉先;彭國雄
• 申請（專利權）人: 重慶大學
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/56;C12N15/63;A01N63/04;A01P7/04;C12R1/645;C12R1/79
• 代理公司: 重慶弘旭專利代理有限責任公司 50209
• 代理人: 周韶紅

1.昆蟲病原真菌轉基因菌株，其特征在于：所述轉基因菌株含有同源或異源酸性海藻糖酶組成性外源基因。

2.如權利要求1所述的昆蟲病原真菌轉基因菌株，其特征在于：所述酸性海藻糖酶組成性外源基因為pBarEx-ATM或pBGFP-ATM。

3.如權利要求1或2所述的昆蟲病原真菌轉基因菌株，其特征在于：所述昆蟲病原真菌為白僵菌、綠僵菌、擬青霉或輪枝菌。

4.如權利要求3所述的昆蟲病原真菌轉基因菌株，其特征在于：所述昆蟲病原真菌轉基因菌株，是通過構建酸性海藻糖酶基因全長cDNA組成性表達載體，然后建立液生分生孢子轉化體系，再進行選擇性地篩選得到的。

5.如權利要求1或2所述的昆蟲病原真菌轉基因菌株，其特征在于：所述昆蟲病原真菌轉基因菌株，是通過構建酸性海藻糖酶基因全長cDNA組成性表達載體，然后建立液生分生孢子轉化體系，再進行選擇性地篩選得到的。

6.如權利要求4所述的昆蟲病原真菌轉基因菌株，其特征在于：所述構建酸性海藻糖酶基因全長cDNA組成性表達載體中的酸性海藻糖酶基因來自綠僵菌CQMa102。

7.如權利要求1或2所述的昆蟲病原真菌轉基因菌株，其特征在于：

所述轉基因菌株是通過PCR聚合酶鏈式反應擴增綠僵菌CQMa102酸性海藻糖酶基因全長cDNA核酸序列，并將其克隆到以除草劑抗性基因——Bar基因為篩選標記的真菌表達載體pBarEx或以Benomyl抗性基因——β-微管蛋白基因為篩選標記的真菌表達載體pBGFP，使ATM基因處于來自構巢曲霉3-磷酸甘油醛脫氫酶gpdA基因的啟動子或磷酸丙糖異構酶tpiA基因的啟動子與色氨酸合成酶trpC基因的終止子控制之下，得到海藻糖酶基因組成性表達載體pBarEx-ATM或pBGFP-ATM；再建立利用基因槍法轉化綠僵菌或白僵菌液生分生孢子的體系，將pBarEx-ATM或pBGFP-ATM整合到綠僵菌、白僵菌基因組、擬青霉或輪枝菌中；最后經過抗性篩選和聚合酶鏈式反應法篩選得到的。

8.如權利要求1-7任一項所述的昆蟲病原真菌轉基因菌株的制備方法，其特征在于：

a.構建酸性海藻糖酶基因組成性表達載體

首先根據pBGFP構建絲狀真菌表達載體pBarEx：設計引物1與引物2從構巢曲霉基因組DNA中擴增色氨酸合成酶啟動子PtryC序列；設計引物3與引物4從pCAMBIA3300中擴增Bar基因序列；以引物1與引物4，采用融合PCR擴增PtryC控制下的BarCassette；將pBGFP與Bar?Cassette分別采用AatII與BamHI雙酶切后，用T4連接酶連接構建成絲狀真菌表達載體pBarEx；所述引物1為5’-attagacgtcgcaggtcgacagaagaatgac-3’，下劃線為Aat?II酶切位點；所述引物2為5’-gtcggccgggcgtcgttctgggctcatggtagatccactagagcggccgc-3’；所述引物3為5’-gcggccgctctagtggatctaccatgagcccagaacgacgcccggccgac-3’，與引物2反向互補系列，其中atg為Bar基因起始密碼子；所述引物4為5’-cgcggatccagcttttattagatctcggtgac-3’，下劃線為BamHI酶切位點；

其次，根據綠僵菌CQMa102酸性海藻糖酶基因全長cDNA核酸序列設計的引物5與引物6，以綠僵菌CQMa102cDNA為模板，通過聚合酶鏈式反應擴增出兩端分別帶有ClaI與SmaI酶切位點的3303bp的ATM基因全長cDNA序列，并將其克隆到絲狀真菌表達載體pBarEx或pBGFP的ClaI和SmaI位點之間，使ATM基因處于來自構巢曲霉3-磷酸甘油醛脫氫酶gpdA基因的啟動子與色氨酸trpC基因的終止子控制之下，得到海藻糖酶基因組成性表達載體pBarEx-ATM或pBGFP-ATM；pBarEx-ATM或pBGFP-ATM表達載體用CaCl₂法轉入大腸桿菌中并進行擴增，載體大量提取的產物經SpeI線性化后去磷酸，再經酚-氯仿抽提得到所述線性化組成性表達載體；所述引物5為5’-ccatcgatatgcgcgcgactcccatg-3’，下劃線為ClaI酶切位點；所述引物6為5’-tcccccgggctaaaacgctctaccctt-3’，下劃線為SmaI酶切位點；

b.建立利用基因槍法轉化昆蟲病原真菌液生分生孢子的體系

將1ml濃度為10⁷個/ml的綠僵菌CQMa102或白僵菌CQBb022成熟分生孢子水懸浮液接種于裝有100ml?1/4強度薩氏液體培養基的250ml三角瓶中，28℃，250rpm振蕩培養3天，四層滅菌紗布過濾后6000g離心5分鐘沉淀液生分生孢子，用無菌水重懸清洗2次，最后20％無菌甘油重懸使孢子濃度達10⁸個/ml，分裝后-80℃保存；所述薩氏液體培養基為10g/l葡萄糖，2.5g/l蛋白胨，5.0g/l酵母浸膏，初始pH?6.5；

c.轉化與篩選

轉化時取出50μl所述液生分生孢子懸浮液與滅菌平皿中央，使其直徑達到1cm，然后放入75％乙醇消毒的基因槍室內用于轉化：按照Bio-Rad系統提供的方法進行金粉的處理和線性載體pBarEx-ATM或pBGFP-ATM的包埋，并利用該系統進行微粒子轟擊；轟擊后在超凈臺上取出孢子液，用5ml無菌水稀釋，取100ul涂布于除草劑草丁膦或苯萊特篩選培養基平板上，28℃培養；綠僵菌采用80ug/ml?PPT或5ug/ml苯萊特的查氏平板篩選，白僵菌篩選采用10ug/ml?PPT或5ug/ml苯萊特的查氏平板篩選，10天后挑取正常生長單菌落，在相應篩選培養基與1/4SDA平板上交替傳代5次后提取DNA，利用5’-gactgcccgcattgagaag-3’與5’-agatggagga?gttggtgttg-3’的特異引物對，經PCR驗證轉基因菌株Bar基因，或利用5’-gcttactcctccttgacaccac-3’與5’-agccgagtatggtaaccaaggg-3’的特異引物對，驗證轉基因菌株β-Tubulin基因，得到穩定轉基因菌株。

9.如權利要求1-7任一項所述的昆蟲病原真菌轉基因菌株在制備真菌農藥中的應用。