[發(fā)明專利]一種富集轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中外源DNA的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010200491.6
• 申請日: 2010-06-09
• 公開（公告）號: CN101864489A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 許崇任;舒暢;許昌;王戎疆
• 申請（專利權(quán)）人: 北京大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/10
• 代理公司: 北京路浩知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;張慶敏

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及檢測樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分的方法，尤其涉及一種基于磁珠-核酸探針平臺特異性的富集轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中外源DNA的方法，其能夠提高最終用于檢測反應(yīng)的DNA模板中外源DNA豐度。

背景技術(shù)

現(xiàn)在實驗室中檢測樣品中是否含有轉(zhuǎn)基因成分，一般是分析樣品的DNA中是否含有外源DNA或者分析樣品的蛋白中是否含有外源蛋白成分。在分析樣品的DNA時，涉及到樣品DNA的提取，目的片段擴增(PCR)以及擴增效果的檢測(熒光定量PCR實時檢測、電泳圖譜分析、dHPLC分析等)。

現(xiàn)在使用的轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品DNA提取的常規(guī)方法分為兩大類：一類為液相提取法，包括堿裂解法和酚氯仿抽提法等，通過物理方法或化學(xué)試劑破碎樣品，釋放基因組DNA，再根據(jù)萃取和相分離等原理，利用不同的溶劑將DNA和蛋白、多糖及脂質(zhì)等成分分開；另一類為固相提取法，利用硅膠微球、表面修飾的磁性微球、硅膠柱等吸附DNA，達到分離提取DNA的效果(參考文獻：DNA?Isolation?From?Dry?and?Fresh?Samples?of?Polysaccharide-Rich?Plants，Plant?Molecular?Biology?Reporter?20：415a-415f，December?2002；PCR-Based?Detection?of?Genetically?Modified?Soybean?and?Maize?in?Raw?and?Highly?Processed?Foodstuffs，BioTechniques?Vol.31，No.22001；Soybean?Seeds?Sampling?and?DNA?Extraction，CRLVL13/05XP?14?May?2007?andCRLVL05/06XP?18February?2008)。基于這些方法，許多公司推出了相關(guān)的商品化試劑盒，如Qiagen，ABI，Takara(相關(guān)網(wǎng)址：http://www1.qiagen.com/Products/GenomicDnaStabilizationPurification/AnimalPlantSamples.aspx；http://www.takara.com.cn/？action＝Page&Plat＝product&subclass＝1)。

上述所有的方法提取的都是樣品的總DNA，在轉(zhuǎn)基因成分分析時，用上述方法所獲得的DNA中外源基因DNA的豐度的高低與樣品中的轉(zhuǎn)基因成分的多少相對應(yīng)，這使得通過PCR擴增檢測外源基因和內(nèi)參基因并比較兩者之間的數(shù)量關(guān)系，可以知道轉(zhuǎn)基因成分在樣品中的含量，這也是轉(zhuǎn)基因成分分析定量檢測的基礎(chǔ)。這種方法存在一個檢測極限的問題，因為我們現(xiàn)在所用的檢測方法如PCR擴增或熒光定量PCR實時檢測，每個檢測反應(yīng)所用的DNA模板量在25～500ng，若檢測樣品中轉(zhuǎn)基因成分含量較低時，會因為樣品中含有的外源DNA拷貝數(shù)太少，造成結(jié)果的假陰性。解決這一問題的方法，一方面是通過優(yōu)化PCR反應(yīng)體系，盡可能提高PCR的檢測限；另一方面是從樣品制備方面入手，提高最終用于檢測反應(yīng)的DNA模板中外源DNA的豐度。

發(fā)明內(nèi)容

鑒于上述情況，本發(fā)明的目的在于提供一種能夠提高最終用于檢測反應(yīng)的DNA溶液中外源DNA豐度的，富集轉(zhuǎn)基因生物及產(chǎn)品中外源DNA的方法。

本發(fā)明在常規(guī)提取基因組DNA的基礎(chǔ)上，再將獲得的基因組DNA直接或用適當(dāng)限制性內(nèi)切酶酶切后，稀釋成適當(dāng)濃度溶液，將生物素標(biāo)記的目標(biāo)基因的核酸探針加入到溶液中，待探針和目標(biāo)基因(外源基因以及內(nèi)標(biāo)準基因)雜交后，加入表面包被有鏈霉親和素的磁性顆粒，使其形成一個生物素-親和素系統(tǒng)，此時生物素會和鏈霉親和素特異性結(jié)合。隨后利用磁場快速富集磁性微球，即可將目標(biāo)基因特異性地提取出來。由此可以將微量的DNA富集起來(見圖1)。

本發(fā)明提供一種富集轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品中外源DNA的方法，其包括以下步驟：

1)對轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品進行DNA提取；

2)向步驟1)得到的DNA提取液中加入緩沖液和生物素標(biāo)記的核酸探針，混勻后經(jīng)過變性、退火冷卻至室溫；

3)向經(jīng)所述步驟2)獲得的溶液中，加入表面標(biāo)記有鏈霉親和素的磁珠，充分混勻后，在磁場中吸附磁珠，用緩沖液清洗磁珠；

4)將經(jīng)所述步驟3)所得的磁珠，置于緩沖液中，加熱到80℃以上，保持一段時間后，取上清溶液，獲得富集的外源DNA片段。

其中，在步驟1)中，所述產(chǎn)品為植物組織、種子或者其經(jīng)深加工得到的產(chǎn)品。