[發明專利]一種用于微生物采油過程優勢菌群監測的方法

無效

• 申請號: 201010199656.2
• 申請日: 2010-05-30
• 公開（公告）號: CN101864488A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 黃永紅;魏利;任國領;伍曉林;宋考平;侯兆偉;卞立紅
• 申請（專利權）人: 大慶石油管理局
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 大慶知文知識產權代理有限公司 23115
• 代理人: 孫淑榮

技術領域：

本發明涉及油田采油領域中一種用于微生物采油過程優勢菌群監測的方法。

背景技術：

隨著三次采油技術的發展，大慶油田進入高含水開發后期，對于低滲透油田而言，微生物采油技術具有較好的應用前景。對于維持油田的高產穩產，以及可持續發展具有重要的意義。

油藏微生物群落的解析和認知是開發和應用微生物采油技術的基礎。傳統上采用純培養的方法來研究和認識油藏微生物群落，由于傳統培養的方法存在著：(1)沒有充分考慮和模擬環境條件，導致只有極少數的微生物(0.01％～1％)能夠在人工培養條件下成活和被培養；(2)人工培養條件對微生物具有不同的選擇性和富集效果，因而所檢測到的微生物在種類、數量和功能上的相對情況是通過選擇和富集后的結果，并不能完全準確地反映油藏中的真實情況；(3)無法準確地研究和了解油藏中微生物生態系統的規律；(4)無法指導人們科學地調控油藏微生物群落達到提高采收率目的等問題。所以利用傳統培養方法對油藏微生物群落的認知與實際情況存在較大的偏差，從而導致無法對油藏微生物群落進行準確、有效地調控，也無法高效地提高原油采收率。

目前，通過純培養技術分離到的微生物僅占自然界的0.1％～15％左右，隨著分子生物學和系統發育分析方法的發展，尤其是基于16SrRNA基因的PCR擴增和探針雜交技術，能使我們更準確全面地認識特定生態系統中的微生物種群多樣性，通過分子生物學的方法對油藏微生物生態系統的研究報道還比較少。其中Orphan等通過對樣品總DNA建立了16S?rDNA克隆文庫分析了高溫油田微生物群落結構的組成；Watanabel等通過熒光原位雜交(FISH)、構建文庫、對原油儲坑地層水中微生物群落進行了研究，并通過競爭PCR(cPCR)對其中優勢菌群進行定量分析。所有研究結果表明原油儲層存在很高的微生物多樣性，這些結果使人們進一步了解了原油儲層微生物生態系統。

發明內容：

為了克服背景技術中存在的不足，本發明提供一種用于微生物采油過程優勢菌群監測的方法，該方法能準確反映油藏微生物真實數量，能夠準確而且快速地解析采油微生物在油藏中分布、遷移和變化，為提高石油采收率提供重要的理論指導。

本發明的技術方案是：本發明的方法包括下列步驟：

(1)、首先取油井采出液為樣品，對樣品中微生物的總DNA進行提?。?/p>

(2)、篩選合適的PCR-DGGE引物，通過對已知的用于PCR-DGGE的引物，進行篩選；

(3)、篩選引物的PCR擴增體系的優化；

(4)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)優化；

(5)、優勢條帶的膠回收測序；

(6)、優勢條帶的網絡比對和分析。

上述方案中總DNA的提取：①將1mL油井采液振蕩5min，然后3000r/min離心，留上清液；②加入2倍體積的10×PBS進行洗滌，振蕩5min，然后12000r/min離心5min，去掉上清液；③加入10×PBS緩沖液100μL，然后超聲40s；④用華舜“DNA小量細菌提取試劑盒”，進行后續的DNA提取，然后保存在-20℃冰箱中；

上述方案中篩選適合步驟(1)提取的DNA的PCR-DGGE引物，確定的引物為，DQF338：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGG?CACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；DQR534：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’；

上述方案中引物的PCR擴增體系：PCR反應體系(20μL)如下：10×buffer?2.0μL，2.0mmol/L?dNTP?2μL，10pmol/L引物各1μL，TaqDNA酶0.3μL；PCR擴增條件為95℃預變性5min，94℃變性1min，52℃退火30s，72℃延伸2min，30個循環，72℃延伸20min。

上述方案中變性梯度凝膠電泳(DGGE)條件：①變性梯度膠的制備：使用梯度混合裝置，制備6％(w/w)和8％(w/w)的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度從40％到60％，100％的變性劑為7mol/L的尿素和40％(w/w)的去離子甲酰胺的混合物，其中變性劑和丙烯酰胺的濃度從膠的上方向下方依次遞增；②PCR樣品的加樣：待變性梯度膠完全聚合后，將膠板放入裝有電泳緩沖液的電泳槽中，取PCR樣品5μl和5μl的10×加樣緩沖液混合后加入上樣孔；③電泳及染色：引物擴增片斷，在130V的電壓下，60℃電泳7h；引物電泳結束后，將凝膠進行銀染；④膠圖掃描：將染色后的凝膠用UMAX?PowerLook?1000透射掃描儀掃描后獲取膠圖。