[發明專利]一種用于微生物采油過程優勢菌群監測的方法

無效

• 申請號: 201010199656.2
• 申請日: 2010-05-30
• 公開（公告）號: CN101864488A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 黃永紅;魏利;任國領;伍曉林;宋考平;侯兆偉;卞立紅
• 申請（專利權）人: 大慶石油管理局
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04
• 代理公司: 大慶知文知識產權代理有限公司 23115
• 代理人: 孫淑榮

1.一種用于微生物采油過程優勢菌群監測的方法，該方法包括下列步驟：

(1)、首先取油井采出液為樣品，對樣品中微生物的總DNA進行提取；

(2)、篩選合適的PCR-DGGE引物，通過對已知的用于PCR-DGGE的引物，進行篩選；

(3)、篩選引物的PCR擴增體系的優化；

(4)、變性梯度凝膠電泳(DGGE)優化；

(5)、優勢條帶的膠回收測序；

(6)、優勢條帶的網絡比對和分析。

2.根據權利要求1所述的用于微生物采油過程優勢菌群監測的方法，其特征在于：總DNA的提取：①將1mL油井采出液振蕩5min，然后3000r/min離心，留上清液；②加入2倍體積的10×PBS進行洗滌，振蕩5min，然后12000r/min離心5min，去掉上清液；③加入10×PBS緩沖液100μL，然后超聲40s；④用“DNA小量細菌提取試劑盒”，進行后續的DNA提取，然后保存在-20℃冰箱中；

3.根據權利要求1所述的用于微生物采油過程優勢菌群監測的方法，其特征在于：篩選適合步驟(1)提取的DNA的PCR-DGGE引物，確定的引物為，DQF338：5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’；DQR534：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’；

4.根據權利要求1所述的用于微生物采油過程優勢菌群監測的方法，其特征在于：引物的PCR擴增體系：PCR反應體系(20μL)如下：10×buffer?2.0μL，2.0mmol/L?dNTP?2μL，10pmol/L引物各1μL，Taq?DNA酶0.3μL；PCR擴增條件為95℃預變性5min，94℃變性1min，52℃退火30s，72℃延伸2min，30個循環，72℃延伸20min。

5.根據權利要求1所述的用于微生物采油過程優勢菌群監測的方法，其特征在于：變性梯度凝膠電泳(DGGE)條件：①變性梯度膠的制備：使用梯度混合裝置，制備6％(w/w)和8％(w/w)的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度從40％到60％，100％的變性劑為7mol/L的尿素和40％(w/w)的去離子甲酰胺的混合物，其中變性劑和丙烯酰胺的濃度從膠的上方向下方依次遞增；②PCR樣品的加樣：待變性梯度膠完全聚合后，將膠板放入裝有電泳緩沖液的電泳槽中，取PCR樣品5μl和5μl的10×加樣緩沖液混合后加入上樣孔；③電泳及染色：引物擴增片斷，在130V的電壓下，60℃電泳7h；引物電泳結束后，將凝膠進行銀染；④膠圖掃描：將染色后的凝膠用UMAX?PowerLook?1000透射掃描儀掃描后獲取膠圖。

6.根據權利要求1所述的用于微生物采油過程優勢菌群監測的方法，其特征在于：優勢條帶的膠回收測序：用膠回收試劑盒切膠回收，后與pGEM-T載體連接，轉化到大腸桿菌TOP10感受態細胞；LB固體培養基中加入氨芐青霉素Amp(5μg/mL)和X-gal，藍白斑篩選轉化子；提取質粒，用載體引物T7：5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’和SP6：5’-ATTTAG?GTGACACTATAGAAT-3’檢測；然后去測序。

7.根據權利要求1所述的用于微生物采油過程優勢菌群監測的方法，其特征在于：優勢條帶的網絡比對和分析：所測定的序列與GenBank數據庫中的已知序列進行相似性比較分析，確定是否為采油菌種和優勢菌種。