[發明專利]特定長度的肝素寡糖的制備方法及用途

無效

• 申請號: 201010199546.6
• 申請日: 2010-06-13
• 公開（公告）號: CN102277396A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 黃欣
• 申請（專利權）人: 黃欣
• 主分類號: C12P19/00
• 分類號: C12P19/00;C12N9/88;C12R1/15
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明屬于醫藥技術領域，更確切地說，是涉及一種用肝素酶生產肝素寡糖的方法。

背景技術

心腦血管疾病是中老年人的常見病和多發病，在許多國家和地區的疾病譜和死亡譜中均居于首位。動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是心腦血管疾病的主要病理學基礎，因而防治AS是防治心腦血管疾病的根本措施。AS的發病過程漫長，病因和發病機制仍不十分清楚。近年來，隨著細胞生物學、分子生物學、免疫學等學科的發展和相互滲透，對AS的病因學有了新的認識和發展。AS的發生過程是多因素參與的，涉及動脈壁細胞、細胞外基質、血液成分、血流動力學、環境及遺傳等諸多方面。

肝素是一種粘多糖，自1916年發現其抗凝作用后，至今已有半個多世紀，肝素廣泛用于抗凝、抗血栓、抗炎、抗過敏和降血脂等，有著廣泛的應用前景。然而，肝素在臨床應用時，人們發現其存在出血及肝素誘導的血小板減少等副作用，在某種程度上限制了肝素的臨床應用，隨著對肝素結構研究的不斷深化，國內外藥業公司在上世紀90年代相繼開發了低分子量肝素，低分子量肝素是肝素經化學降解或酶降解而得到的平均分子量在3000～7000道爾頓之間的片段，低分子量肝素不僅用于預防及治療深靜脈血栓，而且用于炎癥等方面。但低分子量肝素仍為不同糖鏈長度的肝素寡糖的混合物，隨著分離純化技術的不斷進步，制備特定糖鏈長度的肝素寡糖已經成為可能，而且肝素寡糖由于其糖鏈的長度不同可能呈現不同的生物學功能，因此以特定長度肝素寡糖為基礎的藥物設計、研究和開發將展示出誘人的前景。

肝素酶是一種能夠降解肝素類物質的裂合酶，降解肝素的主要特點是產生不飽和雙鍵的糖醛酸和帶有還原末段的葡萄糖胺.關于肝素酶來源的報道不多，目前，微生物來源的肝素酶有Calliher?P.M.(1981)報道的肝素黃桿菌(Flavobacterium?heparinum?ATCC?13125)Watanabe?M(1998)報道的解肝素普雷沃氏菌(Prevotella?heparinolytica)Linhardt?R.J(1986)報道的從瘤胃中分離得到的擬桿菌(Bacteroidessp)和Kim?B.T.(2000)報道的從人腸道中分離出來的糞擬桿菌(Bacteroides?stercoris?HJ-15)及Jigyodan?S.(1991)發表專利(JP3247297)報道的芽孢桿菌(Bacillus?sp.BH100).但是，直到目前為止，肝素黃桿菌是商品肝素酶的唯一來源.

肝素黃桿菌肝素酶也是目前唯一經系統研究的肝素酶.Yang?V.C.(1985)Nader?H.B.(1990)和lohse?D.L.(1992)都分別報道了肝素黃桿菌肝素酶的純化和性質研究結果.已從肝素黃桿菌中分離純化出三個肝素酶，分別為肝素酶I?II和III.這三種肝素酶的酶學特性各不相同，酶I?II?III的分子量分別為42.8KD，84.1KD，70.8KD；等電點分別為pH8.5，pH9.0，pH10.0；最適作用溫度分別為35℃，40℃，45℃；最適作用pH分別為7.15，7.30，7.60。更重要的是它們的底物特異性和作用方式不同。肝素酶I是外切型的，具有連續外切肝素的活性，也含少量的內切酶的活性(＜10％)。肝素酶II是內切型的，但底物專一性不高，既能作用肝素又能作用硫酸乙酰肝素。肝素酶III是內切型的，但只能作用硫酸乙酰肝素，不能降解肝素。擬桿菌肝素酶雖然也進行了純化，但性質研究不系統。

肝素酶的用途又多種。可用于在體外循環中肝素的消除，制備活性肝素寡糖片段，也是肝素精確結構的確定及其結構與功能關系研究不可缺少的工具酶。

肝素是由糖醛酸(L-艾杜糖醛酸和D-葡萄糖醛酸)和D-葡萄糖胺以1-4糖苷鍵連接起來的大分子的糖胺聚糖(GAG)，其分子結構極為復雜且不均一，至今其精確結構仍不清楚。