[發明專利]鷓鴣B淋巴細胞刺激因子cDNA及其克隆方法和重組應用

無效

• 申請號: 201010199528.8
• 申請日: 2010-06-13
• 公開（公告）號: CN101870975A
• 公開（公告）日: 2010-10-27
• 發明（設計）人: 任文華;張雙全;陳傳梅
• 申請（專利權）人: 南京師范大學
• 主分類號: C12N15/19
• 分類號: C12N15/19;C12N15/10;C07K14/52;A61K38/19;A61P37/04
• 代理公司: 南京知識律師事務所 32207
• 代理人: 盧亞麗

技術領域

本發明涉及生物基因工程領域，具體涉及鷓鴣B淋巴細胞刺激因子cDNA及其克隆、表達技術。

背景技術

人B淋巴細胞激活因子(hBAFF)，也稱為BLyS、THANK、TALL-1和TNFSF13B等，1999年在人單核細胞中首次發現，是腫瘤壞死因子家族的重要成員，與人體免疫調控密切相關。它主要在外周血單核細胞、脾臟、淋巴結和骨髓等組織中表達。hBAFF具有很強的B細胞趨化性，在體外它作為B細胞增殖和分化的共刺激因子，能誘導活化的B細胞分泌大量的IgG、IgA和IgM等免疫球蛋白，對于休眠B細胞，hBAFF雖不能獨立激活使之進入細胞周期循環，但通過上調細胞表面的抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-X_L的表達，延長休眠B細胞的壽命。hBAFF在體內可以促進脾臟內T1-B細胞向T2-B細胞過渡，并促進成熟B細胞的發育。hBAFF的正常表達是脾臟生發中心形成、抗體親和力成熟、記憶性B細胞形成及B細胞正常發育的必要條件。另外，hBAFF可以協同刺激T細胞增值，誘導免疫球蛋白的類別轉換重組。hBAFF也具有TNF抑殺腫瘤細胞的特性，能與B系腫瘤細胞膜上受體結合，引起B系腫瘤細胞(如Raji細胞)凋亡。由于hBAFF是一個新的治療自身免疫性疾病及B細胞淋巴瘤的分子靶點，自從被發現以來就顯示了巨大的臨床應用前景，在短短的幾年時間里，美國HGSI公司經FDA批準先后有3項與BAFF有關的產品針對四類疾病進入臨床試驗研究：(1)2002年2月HGSI公司的rhBAFF獲得了美國FDA第一個“Orphan?drug”的銷售許可，有效期為7年。主要針對人體CVID疾病，近期該項目已進入Ⅲ三期臨床研究。(2)2001年11月開發BAFF單克隆抗體(LymphoStat-BTM)，主要針對紅斑狼瘡(SLE)和其它自身免疫性疾病，近期該項目已完成Ⅲ期臨床試驗。(3)2002年1月I131標記的重組hsBAFF(LymphoRad131)主要針對B系淋巴細胞腫瘤(如多發性骨髓細胞瘤等)。

檢索GenBank、EMBL和DDBJ等國際三大核酸序列數據庫可知，家禽的雞、鴨和鵝的BAFF?cDNA全長序列已被克隆，序列號分別是AF506010、DQ445092和DQ874394。鷓鴣B淋巴細胞刺激因子(pBAFF)cDNA還未被克隆出來，關于鷓鴣BAFF基因甚至其TNF家族的細胞因子研究在國內外均屬空白。鷓鴣是具有十分重要經濟價值的養殖禽類，而其B淋巴細胞作為靶細胞常受到馬立克氏病病毒(MDV)、禽白血病病毒(ALV)、網狀內皮增生癥病毒(REV)和傳染性法氏囊病(IBD)等等的威脅，引起機體免疫抑制，發生原發感染甚至死亡，甚至遭受其它病原侵襲而導致繼發感染，對養禽業造成更大的損失，對人類的健康可能造成潛在的危害。由于B淋巴細胞刺激因子(pBAFF)具有較強的免疫增強能力，基因工程鷓鴣BAFF蛋白有可能開發成一種能增強鷓鴣免疫能力的生物制劑，用于體質弱、免疫功能低下的病鷓鴣，增加鷓鴣抗病毒能力，尤其是在禽流感對人類已構成威脅的今天。近年來，隨著對細胞因子研究的不斷深入和分子生物學技術的發展，大量的禽類細胞因子得以克隆及重組表達，許多細胞因子基因工程藥物面市，給治療禽類疾病提供了新的手段，同時創造了巨大的經濟和社會效益，因此，重組鷓鴣BAFF蛋白具有潛在的巨大市場應用前景。同時，B淋巴細胞刺激因子(BAFF)是新發現的免疫系統重要調控因子，對鷓鴣BAFF的研究有助于探索鷓鴣類的免疫調控機制，推動其免疫系統研究的發展。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種從鷓鴣提取的B淋巴細胞刺激因子cDNA，并提供鷓鴣B淋巴細胞刺激因子cDNA的克隆方法及重組技術。

本發明從鷓鴣中克隆到B淋巴細胞刺激因子cDNA，它具有SEQ?ID?NO.1所示的序列。

鷓鴣B淋巴細胞刺激因子，它具有SEQ?ID?NO.2所示的序列。

本發明的鷓鴣B淋巴細胞刺激因子cDNA的克隆方法如下：

(1)根據已知B淋巴細胞刺激因子的保守序列設計引物：

正義寡核苷酸兼并引物pBAFF1：5’-CTGYY?TGCARCTGATTGCWGACAG-3’(Y＝T/C，R＝G/A，W＝A/T)

反義寡核苷酸兼并引物pBAFF2：5’-GCACCAAARAANGTRYCRTCK?C-3’(N＝A/T/G/C，R＝G/A，Y＝T/C，K＝G/T)

(2)從鷓鴣脾臟提取總RNA。