[發(fā)明專利]獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010198776.0
• 申請(qǐng)日: 2010-06-12
• 公開（公告）號(hào): CN101864394A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 紀(jì)少琿;金立方;季維智
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 昆明亞靈生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 昆明科陽(yáng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 53111
• 代理人: 孫山明

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于動(dòng)物前體細(xì)胞分離及培養(yǎng)液，特別是獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離及培養(yǎng)液。

背景技術(shù)

我國(guó)現(xiàn)有慢性肝炎病人3000萬(wàn)，其中一部分逐步發(fā)展成為肝纖維化，肝纖維化如果進(jìn)一步惡化將導(dǎo)致肝硬化、肝衰竭、門靜脈高壓等。一般說來，早期肝纖維化是可逆的，而晚期肝纖維化即肝硬化則是不可逆的，器官移植是目前治療晚期肝臟疾病唯一可行方案，然而，供體器官嚴(yán)重缺乏限制了其應(yīng)用。

越來越多的研究表明：以肝干(前體)細(xì)胞為基礎(chǔ)的細(xì)胞替代治療已成為治療肝臟疾病新的希望。成體肝臟前體細(xì)胞(Hepatic?Progenitor?cells，HPCs)具有較強(qiáng)的細(xì)胞增殖及分化為特定細(xì)胞類型的能力，較低的畸胎瘤生成率，而沒有胎兒來源的HPCs和胚胎干細(xì)胞存在的倫理問題，因此被認(rèn)為是細(xì)胞替代治療晚期肝臟疾病的理想種源細(xì)胞。

目前已分離到多種類型的成體HPCs。來源于人、小鼠和大鼠病理肝臟中的卵圓細(xì)胞(oval?cells)是最早被鑒定具有HPCs功能的細(xì)胞，卵圓細(xì)胞在體內(nèi)外具有很強(qiáng)的增殖能力，并能分化為肝細(xì)胞或膽管上皮細(xì)胞(biliaryepithelial?cells，BECs)的能力。但由于細(xì)胞分離是一種甚為復(fù)雜的技術(shù)，要做到最大限度的富集所需的細(xì)胞，同時(shí)減少其他細(xì)胞的百分比，要求細(xì)胞分離培養(yǎng)的每一個(gè)環(huán)節(jié)都要經(jīng)過比較分析，才能得到一個(gè)簡(jiǎn)單、高效、穩(wěn)定的體系。目前還沒有從正常的成體肝臟中得到與卵圓細(xì)胞相同表型一致細(xì)胞的報(bào)道。成熟的肝細(xì)胞由于在體外可以分化為膽管上皮細(xì)胞或表達(dá)膽管上皮細(xì)胞的相關(guān)蛋白，并可參與再生膽管的重塑，因此也被認(rèn)為是成體HPCs細(xì)胞中的一種，遺憾的是成熟的肝細(xì)胞在體外很難擴(kuò)增培養(yǎng)。

除了卵圓細(xì)胞和肝細(xì)胞外，來源于小鼠、大鼠和豬健康的成體肝上皮細(xì)胞(liver?epithelial?progenitor?cells，LEPCs)具有HPC的特性，這些上皮細(xì)胞呈現(xiàn)干細(xì)胞特有的擴(kuò)增能力、并能分化為肝臟特定的細(xì)胞類型，移植后可恢復(fù)受損肝臟的肝功能水平，所有這些特性表明：肝臟上皮前體細(xì)胞是潛在的細(xì)胞替代治療理想的供體細(xì)胞。同樣，從嚙齒類，人以及SV40T轉(zhuǎn)染的食蟹猴的胎兒肝臟也可分離到類似的肝臟上皮細(xì)胞。

許多研究進(jìn)行了從人的成體肝臟中分離HPCs的嘗試。利用特定的培養(yǎng)條件可從正在進(jìn)行肝切除的病人的肝內(nèi)分離到一種能在體外長(zhǎng)期增殖的肝干細(xì)胞(human?hepatic?stem?cells，HHSC)。然而，該細(xì)胞群的表達(dá)模式以及分化潛力都表明它們更加類似于間充質(zhì)干細(xì)胞(mensenchymal?stem?cells，MSCs)而不是傳統(tǒng)意義上的HPCs。最近，從人健康的成體或肝切除的肝臟中得到了呈現(xiàn)肝膽表達(dá)模式的肝上皮細(xì)胞，提示它們可能是潛在的前體細(xì)胞。但目前報(bào)道并沒有完全證實(shí)肝臟前體細(xì)胞的特性，如細(xì)胞的雙向(肝和膽)分化能力。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種可應(yīng)用于獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法，所分離得到的細(xì)胞能夠?yàn)殪`長(zhǎng)類各個(gè)物種的成體肝臟前體細(xì)胞的分離培養(yǎng)和細(xì)胞分化機(jī)制的研究，尤其是作為替代治療晚期肝臟疾病的理想種源細(xì)胞奠定基礎(chǔ)。

本發(fā)明目的通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：

(1)取5-10克的獼猴成體肝臟組織，用PBS浸泡洗滌3次，剪成小塊，用含5mg/ml的IV型膠原酶的DMEM消化組織塊30～60分鐘；

(2)收集上清液中的細(xì)胞，用DMEM洗三次后以1200轉(zhuǎn)/分速度離心5分鐘；

(3)將收集到的細(xì)胞置于10％胎牛血清DMEM的密封離心管中懸浮培養(yǎng)，以形成細(xì)胞團(tuán)塊；

(4)挑出單個(gè)的細(xì)胞團(tuán)塊，接種于大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板；

(5)細(xì)胞培養(yǎng)液含有10mmol/L?nicotinamide，1x?ITS，100U/mlpenicillin，100μg/ml?streptomycin的DMEM/F12(3∶1)，加入10％FBS，50ng/mL表皮生長(zhǎng)因子EGF，10ng/ml肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF；

(6)待細(xì)胞在培養(yǎng)板上長(zhǎng)滿后，用trypsin-EDTA在37℃消化10～30分鐘，用流式細(xì)胞術(shù)分選E-cad+細(xì)胞，收集獼猴成體肝臟前體細(xì)胞。

所述的細(xì)胞培養(yǎng)條件為37℃，5％的CO₂，每?jī)商鞊Q一次培養(yǎng)液。

所述步驟(1)在37℃的搖床中，用含5mg/ml的IV型膠原酶的DMEM消化組織塊30分鐘。

所述步驟(3)中密封的離心管中細(xì)胞懸浮液在37℃的搖床中懸浮培養(yǎng)，