[發(fā)明專利]獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離及培養(yǎng)方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010198776.0
• 申請(qǐng)日: 2010-06-12
• 公開（公告）號(hào): CN101864394A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 紀(jì)少琿;金立方;季維智
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 昆明亞靈生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N5/071
• 分類號(hào): C12N5/071
• 代理公司: 昆明科陽(yáng)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所 53111
• 代理人: 孫山明

1.一種獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，包括以下步驟：

(1)取5-10克的獼猴成體肝臟組織，用PBS浸泡洗滌3次，剪成小塊，用含5mg/ml的IV型膠原酶的DMEM消化組織塊30～60分鐘；

(2)收集上清液中的細(xì)胞，用DMEM洗三次后以1200轉(zhuǎn)/分速度離心5分鐘；

(3)將收集到的細(xì)胞置于10％胎牛血清DMEM的密封離心管中懸浮培養(yǎng)，以形成細(xì)胞團(tuán)塊；

(4)挑出單個(gè)的細(xì)胞團(tuán)塊，接種于大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板；

(5)細(xì)胞培養(yǎng)液含有10mmol/L?nicotinami?de，1x?I?TS，100U/mlpenicillin，100μg/ml?streptomycin的DMEM/F12(3∶1)，加入10％FBS，50ng/mL表皮生長(zhǎng)因子EGF，10ng/ml肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子HGF；

(6)待細(xì)胞在培養(yǎng)板上長(zhǎng)滿后，用t?ryps?in-EDTA在37℃消化10～30分鐘，用流式細(xì)胞術(shù)分選E-cad+細(xì)胞，收集獼猴成體肝臟前體細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是細(xì)胞培養(yǎng)條件為37℃，5％的CO₂，每?jī)商鞊Q一次培養(yǎng)液。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是步驟(1)在37℃的搖床中，用含5mg/ml的IV型膠原酶的DMEM消化組織塊30分鐘。

4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是步驟(3)中密封的離心管中細(xì)胞懸浮液在37℃的搖床中懸浮培養(yǎng)。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是步驟(3)中密封的離心管中細(xì)胞懸浮液在37℃的搖床中懸浮培養(yǎng)。

6.根據(jù)權(quán)利要求1、2所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞用步驟(5)中的培養(yǎng)液，在大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板上進(jìn)行培養(yǎng)，可按1∶2或1∶3多次傳代。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞用步驟(5)中的培養(yǎng)液，在大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板上進(jìn)行培養(yǎng)，可按1∶2或1∶3多次傳代。

8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞用步驟(5)中的培養(yǎng)液，在大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板上進(jìn)行培養(yǎng)，可按1∶2或1∶3多次傳代。

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞用步驟(5)中的培養(yǎng)液，在大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板上進(jìn)行培養(yǎng)，可按1∶2或1∶3多次傳代。

10.根據(jù)權(quán)利要求6所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞的分離和培養(yǎng)方法，其特征是所述的獼猴成體肝臟前體細(xì)胞用步驟(5)中的培養(yǎng)液，在大鼠鼠尾膠原鋪板的培養(yǎng)板上進(jìn)行培養(yǎng)，可按1∶2或1∶3多次傳代。