[發(fā)明專利]一種新的大腸桿菌分裂功能相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010197806.6
• 申請日: 2010-06-11
• 公開（公告）號: CN101880653A
• 公開（公告）日: 2010-11-10
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 谷勁松;葉春江
• 申請（專利權(quán)）人: 濟南大學
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12Q1/34;G01N21/31
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物生理學領(lǐng)域，涉及一種新的大腸桿菌分裂功能相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶的發(fā)現(xiàn)。

背景技術(shù)

細菌細胞的分裂機制是迄今為止尚未完全揭示的領(lǐng)域之一^[1-2]。大腸桿菌(Escherichia?coli)基因組的2分鐘區(qū)域有一個與細胞分裂密切相關(guān)的活躍表達基因簇-dcwcluster，這個基因簇的14個已知功能的基因序列中，有一半在E.coli(大腸桿菌)中表達為細胞分裂環(huán)狀復(fù)合體的直接裝配蛋白(FtsL、FtsI、FtsW、FtsQ、FtsA、FtsZ、EnvA)，另一半則表達為肽聚糖合成有關(guān)的連接酶和轉(zhuǎn)移酶等(MurE、MurF、MraY、MurD、MurG、MurC、DdlB)^[3-4]。見附圖1E.coli細胞分裂時，具有GTPase活性的FtsZ蛋白在FtsA蛋白的幫助下，首先自我聚合于細胞中部，形成結(jié)合于質(zhì)膜上的Z環(huán)結(jié)構(gòu)，GTPase水解GTP提供能量使Z環(huán)收縮并牽拉細胞質(zhì)膜內(nèi)陷，驅(qū)動胞質(zhì)分離；隨后FtsI、FtsW等與肽聚糖合成有關(guān)的蛋白依次聚合到Z環(huán)上，所以質(zhì)膜內(nèi)陷同時肽聚糖層合成；在最后裝配的AmiC(非dcw簇蛋白)等水解酶作用下，完成肽聚糖層分離，并通過脂蛋白橋接以生成細胞外膜^[5-7]。

然而，這個有序的細胞分裂Z環(huán)復(fù)合體組裝過程卻被發(fā)現(xiàn)受到細胞內(nèi)S-腺苷甲硫氨酸水平的影響。S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)是細胞代謝途徑中的通用甲基供體，細胞內(nèi)幾乎所有用于甲基化修飾的甲基都來自AdoMet甲硫高能鍵，AdoMet在體內(nèi)主要是由AdoMet合成酶(MetK)通過甲硫氨酸和ATP合成^[8-9]。Newman等發(fā)現(xiàn)當E.coli的AdoMet合成酶水平降低，造成細胞內(nèi)甲基供體AdoMet缺乏時，細胞就不會正常分裂，而是形成十幾或幾十微米長的絲狀菌體^[10]。LaMonte等也發(fā)現(xiàn)，如果將來自T3噬菌體的AdoMet水解酶基因?qū)隕.coli菌體細胞，使胞內(nèi)AdoMet水平下降時，大腸桿菌也形成了長的絲狀體^[11]。進一步研究表明，絲狀菌體中，引發(fā)E.coli細胞分裂的Z環(huán)復(fù)合體裝配可以正常起始，但不會完成，而當亮氨酸調(diào)節(jié)的AdoMet合成酶水平恢復(fù)正常，細胞內(nèi)甲基供體AdoMet不再缺乏時，細胞分裂也隨即恢復(fù)正常^[10]。由此推測，分裂復(fù)合體的某些裝配元件可能需要甲基化修飾后才能被組裝，也可能某些已經(jīng)裝配的蛋白元件必須在甲基化修飾后才能招集到后續(xù)的蛋白元件與之結(jié)合^[10]，再一可能性就是該蛋白元件的轉(zhuǎn)錄和表達過程需要甲基化修飾的參與。

那么細胞分裂過程中，AdoMet所提供的甲基在E.coli細胞分裂調(diào)節(jié)過程中又是由哪個酶進行傳遞的呢？這就是本發(fā)明的切入點。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)大腸桿菌細胞分裂過程起調(diào)節(jié)作用的甲基轉(zhuǎn)移酶。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

我們對文獻資料綜合分析后發(fā)現(xiàn)，最有可能的候選甲基轉(zhuǎn)移酶就是基因同樣位于dcw基因簇上的YabC蛋白。yabB和yabC是位于dcw基因簇前兩位的未知功能基因，它們都是高度同源保守又活躍表達的序列，其中yabC不僅同源保守性高，而且該序列廣泛存在于幾乎所有的細菌分裂基因簇上，而dcw基因簇上其它的基因，甚至于表達為Z環(huán)復(fù)合體中的最重要蛋白的ftsZ基因，都不是所有細菌基因組中必須存在的^[2，12]。而與之相對應(yīng)，在產(chǎn)黃青霉、產(chǎn)黃頭孢霉等細胞分裂不明顯的絲狀真菌的基因組中，我們卻沒有發(fā)現(xiàn)yabC的同源基因序列。

我們將YabC蛋白序列與海棲熱袍菌(Thermotoga?maritima)的已知甲基轉(zhuǎn)移酶1m6y序列^[13]同源比對發(fā)現(xiàn)，YabC蛋白結(jié)構(gòu)中存在明顯的AdoMet結(jié)合位點，如附圖2所示。由此判斷，YabC很可能就是細胞分裂過程中，執(zhí)行甲基化修飾的甲基轉(zhuǎn)移酶。

根據(jù)以上分析，我們進一步通過實驗進行了驗證，首先通過PCR擴增獲取yabC序列，與pGEX質(zhì)粒重組，成功地構(gòu)建了pGST-yabC表達載體，誘導(dǎo)表達、親和層析分離純化得到GST-YabC融合蛋白。

甲基轉(zhuǎn)移酶活性檢測方面，我們建立了基于重組S-腺苷-L-高半胱氨酸(AdoHcy)核苷酶(MTAN，EC?3.2.2.9)和重組S-核糖基高半胱氨酸酶(LuxS，EC3.2.1.148)的酶偶聯(lián)分析檢測技術(shù)(附圖3)。