[發(fā)明專利]一種新的大腸桿菌分裂功能相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010197806.6
• 申請日: 2010-06-11
• 公開（公告）號: CN101880653A
• 公開（公告）日: 2010-11-10
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 谷勁松;葉春江
• 申請（專利權(quán)）人: 濟(jì)南大學(xué)
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12Q1/34;G01N21/31
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• 代理人: 暫無信息

1.一種新的大腸桿菌分裂功能相關(guān)的甲基轉(zhuǎn)移酶-YabC蛋白，其特征在于：該蛋白與大腸桿菌分裂異常的絲狀菌體細(xì)胞裂解液以及甲基供體S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)孵育后，可成功地檢測到甲基轉(zhuǎn)移后生成的共同產(chǎn)物S-腺苷-L-高半胱氨酸(AdoHcy)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述YabC蛋白，其特征在于：

(1)該蛋白對應(yīng)的核酸序列位于大腸桿菌基因組的2分鐘區(qū)域與細(xì)胞分裂密切相關(guān)的活躍表達(dá)基因簇-dcw?cluster上，是高度同源保守又活躍表達(dá)的序列；

(2)該蛋白序列與海棲熱袍菌(Thermotoga?maritima)的已知甲基轉(zhuǎn)移酶1m6y序列同源比對發(fā)現(xiàn)，YabC蛋白結(jié)構(gòu)中存在明顯的AdoMet結(jié)合位點(diǎn)；

(3)該蛋白分子量約為34.9kDa，由分子量約為60kDa的GST-YabC融合蛋白被蛋白酶Factor?Xa酶切后獲得；

(4)該蛋白的甲基轉(zhuǎn)移酶活性通過檢測甲基轉(zhuǎn)移后生成的共同產(chǎn)物S-腺苷-L-高半胱氨酸(AdoHcy)確定。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述GST-YabC融合蛋白，其特征在于：

(1)該融合蛋白是YabC蛋白的基因序列yabC經(jīng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增后、克隆入pGEX(InVitrogen)質(zhì)粒載體、并轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌DH5α中表達(dá)的產(chǎn)物；

(2)該融合蛋白通過谷胱甘肽瓊脂糖4B親和層析柱吸附，經(jīng)過還原性谷胱甘肽洗脫獲得純化的GST-YabC融合蛋白。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述基因序列yabC，其特征在于：是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增的942bp的核酸序列，PCR擴(kuò)增的正向和反向引物分別包含BamHI與XhoI內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述甲基轉(zhuǎn)移后生成的共同產(chǎn)物S-腺苷-L-高半胱氨酸(AdoHcy)，其特征在于：該產(chǎn)物生成量通過基于重組S-腺苷-L-高半胱氨酸核苷酶(MTAN，EC?3.2.2.9)和重組S-核糖基高半胱氨酸酶(LuxS，EC3.2.1.148)的酶偶聯(lián)分析檢測技術(shù)確定。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于重組S-腺苷-L-高半胱氨酸核苷酶(MTAN，EC3.2.2.9)和重組S-核糖基高半胱氨酸酶(LuxS，EC3.2.1.148)的酶偶聯(lián)分析檢測技術(shù)，其特征在于：酶偶聯(lián)分析檢測系統(tǒng)包含有YabC蛋白、MEW402metK84絲狀體細(xì)胞裂解液、S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)，S-腺苷-L-高半胱氨酸核苷酶(MTAN)，1S-核糖基高半胱氨酸酶(LuxS)，Hepes緩沖液，反應(yīng)終止用四倍體積的5，5′-聯(lián)硫-2，2′-雙硝基苯甲酸(DTNB)-鹽酸胍溶液終止反應(yīng)，比色測定生成的5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB)，根據(jù)S-腺苷-L-高半胱氨酸(AdoHcy)與5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算轉(zhuǎn)甲基生成的S-腺苷-L-高半胱氨酸(AdoHcy)量。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的MEW402metK84絲狀體細(xì)胞裂解液，其特征在于：由MEW402metK84絲狀體細(xì)胞超聲波裂解離心后獲得。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的MEW402metK84絲狀體細(xì)胞，其特征在于：

(1)是S-腺苷甲硫氨酸(AdoMet)合成酶基因(metK)的突變菌株；

(2)通過接種含有葡萄糖、高濃度亮氨酸的基本培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)后離心收集細(xì)胞后，再以低的接種量轉(zhuǎn)接含有葡萄糖、低濃度亮氨酸的基本培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)獲得。