[發(fā)明專利]檢測耐藥結(jié)核分支桿菌(MDR-TB)的方法和試劑盒

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010197776.9
• 申請日: 2010-06-10
• 公開（公告）號: CN101845503A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 富國良;羅濤;姜麗麗;高謙
• 申請（專利權(quán)）人: 無錫銳奇基因生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;G01N21/64;C12N15/11
• 代理公司: 杭州裕陽專利事務(wù)所(普通合伙) 33221
• 代理人: 江助菊

1.一種檢測耐藥結(jié)核分枝桿菌的方法，包括：

在一個擴增反應中擴增基因組區(qū)域，其中，所述基因組區(qū)域中的突變引起了結(jié)核分枝桿菌的耐藥；

所述擴增反應的擴增體系包括至少一條標記的寡核苷酸探針，至少一對擴增引物和一個熱穩(wěn)定的DNA聚合酶；

標記的寡核苷酸探針與擴增的基因組區(qū)域雜交形成的熔解曲線分析中產(chǎn)生一個熔解譜；

所述標記的寡核苷酸探針與靶核苷酸序列雜交區(qū)域至少要包含一個突變核苷酸、或包含兩個甚至更多的突變核苷酸，且所述標記的寡核苷酸探針與野生型或突變型靶核苷酸序列的突變位點互補；

所述寡核苷酸探針是雙標記探針，包括一個報告標記和一個猝滅標記；

所述猝滅標記是非熒光猝滅基團，它標記在寡核苷酸探針的3’末端；所述報告標記是熒光基團，它可以標記在寡核苷酸探針內(nèi)部的核苷酸殘基上或5’末端；

當雙標記寡核苷酸探針處于未與擴增的基因組區(qū)域雜交的單鏈構(gòu)象時，猝滅標記能夠猝滅報告標記所發(fā)出的熒光；當雙標記寡核苷酸探針與擴增的基因組區(qū)域雜交時，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，報告標記的熒光不能夠被猝滅，此時，報告標記的熒光強度要遠高于此雙標記寡核苷酸探針未與擴增的基因組區(qū)域雜交而處于單鏈狀態(tài)時的熒光強度；

所述擴增是不對稱擴增，擴增中一條引物的濃度高于另外一條與之配對引物的濃度。

2.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，所述基因組區(qū)域選自以下的基因的一種或多種：其中包括與耐利福(RIF)平相關(guān)的RpoB基因，與耐異煙肼(INH)相關(guān)的KatG基因、mabA(fabG1)-inhA啟動子和oxyR-ahpC基因間區(qū)域，與耐乙胺丁醇(EMB)相關(guān)的embB基因，與耐吡嗪酰胺(PZA)相關(guān)的pncA基因，與耐鏈霉素(STR)相關(guān)的rpsL和rrs基因，與耐左氧氟沙星相關(guān)的gyrA基因；

所述基因組區(qū)域中的突變包括，rpoB基因的511、513、515、516、518、519、522、526、531和533位點，embB基因的306位點，katG基因的315位點，inhA基因的-15和-8位點，ahpC基因-6、-9、-10和-12位點等18個突變位點。

3.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，在標記寡核苷酸的熔解曲線分析中，產(chǎn)生熔解譜的步驟還包括當探針與靶核酸序列分離時，確定擴增產(chǎn)物熒光強度變化負一次導數(shù)(-df/dT)最大值的步驟。

4.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，所述DNA聚合酶是不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶。

5.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，所述擴增是多重檢測反應，反應中至少存在兩條與不同基因組區(qū)域雜交的探針；所述的至少兩條探針的每條可以都與野生型序列匹配，也可以每條都與突變型序列匹配，還可以其中一條與野生型序列匹配，另外一條與突變型序列匹配；所述兩條探針可以包含在單一信號檢測通道內(nèi)檢測的相同或相似的染料標記，或者也可以包含在不同信號檢測通道內(nèi)檢測的不同顏料標記。

6.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，其中一條探針包含不與擴增序列互補的核苷酸，此探針與包含9bp回文結(jié)構(gòu)序列的RpoB基因的81bp核心區(qū)域雜交，上述探針中所包含的不與擴增序列互補的核苷酸阻止了探針自身發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。

7.根據(jù)權(quán)利要求1中的方法，所述引物選自序列表中的SEQ?ID?NO：1～SEQID?NO：16，所述探針選自序列表中的SEQ?ID?NO：17～SEQ?ID?NO：36。

8.一種檢測耐藥結(jié)核分枝桿菌的探針，其特征在于：此探針由25～50個核苷酸組成，在雜交的條件下，它能夠與結(jié)核分枝桿菌RpoB基因81bp的核心區(qū)域雜交；上述探針包括一個標記在3’末端的猝滅標記和一個標記在內(nèi)部核苷酸殘基上或5’末端的報告標記；所述探針雜交在包含RpoB基因526、531和533密碼子的區(qū)域，探針含有與擴增序列不互補的核苷酸；所述探針與包含9bp回文結(jié)構(gòu)序列的RpoB基因的81bp核心區(qū)域雜交；上述探針中所包含的不與擴增序列互補的核苷酸阻止了探針自身發(fā)夾結(jié)構(gòu)的形成。9.根據(jù)權(quán)利要求8中的探針，所述探針選自本說明書序列表中的SEQ?ID?NO：17，SEQ?ID?NO：18，SEQ?ID?NO：26，SEQ?ID?NO：27，SEQ?ID?NO：31。

10.一個從樣本中檢測耐藥結(jié)核分枝桿菌的試劑盒，所述試劑盒包括：至少一對擴增引物和至少一條標記的寡核苷酸探針，此寡核苷酸探針包括一個報告標記和一個猝滅標記；當標記的寡核苷酸探針處于未與靶序列雜交的單鏈構(gòu)象時，猝滅標記能夠猝滅報告標記所發(fā)出的熒光；

當寡核苷酸探針與靶序列雜交時，形成雙鏈結(jié)構(gòu)，報告標記的熒光不能夠被猝滅，此時，報告標記的熒光強度要遠高于此寡核苷酸探針未與靶序列雜交而處于單鏈狀態(tài)時的熒光強度；

其中所述猝滅標記是非熒光猝滅基團，且標記在探針的3’末端；

其中所述報告標記是熒光基團，且標記在在寡核苷酸探針的內(nèi)部核苷酸殘基上或標記在探針的5’末端；

還包括熱穩(wěn)定的且不具有5’核酸酶活性的DNA聚合酶及核酸序列擴增所需其它常用各組分；

其中所述引物選自序列表中的SEQ?ID?NO：1～SEQ?ID?NO：16；

其中所述探針選自序列表中的SEQ?ID?NO：17～SEQ?ID?NO：36。