[發(fā)明專利]檢測(cè)耐藥結(jié)核分支桿菌(MDR-TB)的方法和試劑盒

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010197776.9
• 申請(qǐng)日: 2010-06-10
• 公開（公告）號(hào): CN101845503A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 富國(guó)良;羅濤;姜麗麗;高謙
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 無錫銳奇基因生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12Q1/68
• 分類號(hào): C12Q1/68;C12Q1/04;G01N21/64;C12N15/11
• 代理公司: 杭州裕陽(yáng)專利事務(wù)所(普通合伙) 33221
• 代理人: 江助菊

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種一種微生物檢測(cè)醫(yī)學(xué)體外診斷技術(shù)，特別是涉及一種耐多藥結(jié)核分枝桿菌感染的檢測(cè)方法，以及利用所述方法同時(shí)檢測(cè)多種與結(jié)核耐藥相關(guān)基因突變的試劑盒。

背景技術(shù)

結(jié)核病仍然是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，尤其是在發(fā)展中國(guó)家。據(jù)WHO統(tǒng)計(jì)世界人口的1/3有結(jié)核分支桿菌(mycobacterium?tuberculosis，MTB)感染，是全世界感染性疾病中的第二大殺手。并且近年來結(jié)核分支桿菌的耐藥性呈現(xiàn)顯著的增長(zhǎng)趨勢(shì)。全球約有4.3％的新發(fā)病例和治療后的患者發(fā)生多重耐藥，部分高發(fā)地區(qū)的多重耐藥率高達(dá)10％以上。我國(guó)是結(jié)核病疫情較重的國(guó)家之一，在全球22個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國(guó)家中位居第二。中國(guó)、印度和俄羅斯三個(gè)國(guó)家的結(jié)核耐藥患者總數(shù)約占全球的62％。近期中國(guó)傳染病監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示，結(jié)核病患者數(shù)一直居各種傳染病的首位，全國(guó)約有5.5億人感染結(jié)核病菌，約450萬人患結(jié)核病，200萬人為開放性結(jié)核病，每年因結(jié)核病死亡的人數(shù)高達(dá)13萬。回顧性調(diào)查結(jié)果表明，中國(guó)MTB的總耐藥率為27.8％，耐多藥率為10.7％。這已成為全球性的公共問題，并引起了社會(huì)的普遍重視。

然而結(jié)核病的快速診斷和最佳個(gè)體化治療方案的建立仍然是結(jié)核控制中的重要挑戰(zhàn)之一。由于結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)緩慢，如今廣泛應(yīng)用的耐藥測(cè)定方法均是建立在菌株的基礎(chǔ)上，雖然使用了新的液體培養(yǎng)基，但仍然耗時(shí)較長(zhǎng)，推遲了獲得菌株敏感型的時(shí)間。因此，開發(fā)一種快速準(zhǔn)確診斷耐多藥結(jié)核病的檢測(cè)方法，對(duì)于早期發(fā)現(xiàn)、阻斷耐藥結(jié)核病的傳播，規(guī)范指導(dǎo)用藥，提高耐藥結(jié)核病的治愈率具有非常重要的意義。近年來報(bào)道了許多檢測(cè)結(jié)核耐藥突變的分子生物學(xué)方法，然而這些方法往往需要大量的人力和長(zhǎng)勢(shì)良好的培養(yǎng)基。最近，已經(jīng)成功建立了一些real-time?PCR快速檢測(cè)結(jié)核分支桿菌臨床分離株耐藥突變的方法。但是這些方法往往只可同時(shí)檢測(cè)很少幾種與結(jié)核耐藥相關(guān)的突變基因型，臨床上及可能出現(xiàn)漏檢。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase?chain?reaction，PCR)技術(shù)發(fā)明至今已近20年了，在這期間技術(shù)得到了不斷的發(fā)展，近年來出現(xiàn)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time?quantitative?PCR)技術(shù)實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，它以其特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、定量準(zhǔn)確、速度快、全封閉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)成為了分子生物學(xué)研究中的重要工具。目前real-time?PCR(也稱Q-PCR)所使用的熒光化學(xué)方法主要有五種，分別是：DNA結(jié)合染色，水解探針(TaqMan探針)，分子信標(biāo)(molecular?beacon)，熒光標(biāo)記引物，雜交探針。它們又可分為擴(kuò)增序列特異和非特異的檢測(cè)兩大類。

擴(kuò)增序列非特異性檢測(cè)方法的基礎(chǔ)是DNA結(jié)合的熒光分子，如SYBR?GreenI等熒光染料。Real-time?PCR發(fā)展早期就是運(yùn)用這種最簡(jiǎn)單的方法，在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR?Green?I熒光染料，SYBR?Green?I熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)。熒光染料的優(yōu)勢(shì)在于它能監(jiān)測(cè)任何dsDNA序列的擴(kuò)增，不需要探針的設(shè)計(jì)，使檢測(cè)方法變得簡(jiǎn)便，同時(shí)也降低了檢測(cè)的成本。然而正是由于熒光染料能和任何dsDNA結(jié)合，因此它也能與非特異的dsDNA(如引物二聚體)結(jié)合，使實(shí)驗(yàn)容易產(chǎn)生假陽(yáng)性信號(hào)。

擴(kuò)增序列特異性檢測(cè)方法是在PCR反應(yīng)中利用標(biāo)記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測(cè)產(chǎn)物，它又可分為直接法和間接法。間接的方法就是利用水解探針的策略。目前在real-time?PCR中最廣泛使用的TaqMan系統(tǒng)就是運(yùn)用了這個(gè)原理。PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)，因此探針完整時(shí)，檢測(cè)不到該探針5’端熒光基團(tuán)發(fā)出的熒光。但在PCR擴(kuò)增中，熔液中的模板變性后低溫退火時(shí)，引物與探針同時(shí)與模板結(jié)合。在引物的介導(dǎo)下，沿模板向前延伸至探針結(jié)合處，Taq酶的5’-3’外切酶活性(此活性是雙鏈特異性的，游離的單鏈探針不受影響)將探針5’端連接的熒光基團(tuán)從探針上切割下來，游離于反應(yīng)體系中，從而脫離3’端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，而發(fā)出熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步。