[發明專利]lspD抑制劑篩選模型及IspD抑制劑杜米芬的新用途

有效

• 申請號: 201010196922.6
• 申請日: 2010-06-10
• 公開（公告）號: CN102277411A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 肖春玲;高鵬;楊延輝;熊小椒;關艷;甘茂羅;郝雪秦;劉憶霜
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院醫藥生物技術研究所
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48;G01N21/31;A61K31/14;A61P31/06
• 代理公司: 中國國際貿易促進委員會專利商標事務所 11038
• 代理人: 程泳

技術領域

本發明涉及化學藥物和藥物篩選領域，具體地，本發明涉及一種結核桿菌酶IspD抑制劑的篩選模型，以及IspD抑制劑杜米芬用于制備抗結核治療藥物的用途。?

背景技術

結核病(Tuberculosis，以下簡稱為“TB”)是由結核分枝桿菌(Mycobacterium?tuberculosis)感染引起的慢性傳染性疾病，嚴重危害著人類生命健康。現在全球三分之一的人口已經感染了結核分枝桿菌，并且每年新增結核病病例927萬例，死亡300萬，成為與AIDS、瘧疾并稱的三大傳染病。我國是全球22個結核高負擔國家之一，有5.5億人口感染了TB，患者人數高達550萬，居世界第二位，每天新增結核病患者4000多例。?

結核分枝桿菌，屬于分枝桿菌屬，為結核病的病原菌。結核分枝桿菌的耐藥已成為當前結核病治療中所面臨的最嚴重的問題之一，單藥耐藥、多藥耐藥甚至嚴重耐藥(極端耐藥)的結核分枝桿菌不斷出現和傳播，使傳統的抗TB藥物失去了原有的療效。在過去的三、四十年中，未能開發出真正有效的新型抗TB藥物。而且卡介苗的保護率在發達國家也已經低于50％，在中國則更低。為了應對結核病威脅，迫切需要研制新的抗TB藥物。?

一直以來，細胞壁是篩選抗細菌藥物的首選靶點。結核桿菌的細胞壁對于其生長繁殖至關重要，在細胞壁各成分的合成與組裝過程中有眾多的酶系參與，潛在著多個抗結核藥物的新靶點。而且其中多數的酶是人體內所不存在的，因此靶向細胞壁的藥物具有較好的選擇毒性。?

近幾年的研究結果表明：在某些細菌、原蟲和植物體內存在一條2-?甲基-赤蘚糖醇磷酸(methylerythritol?phosphate，MEP)途徑用于合成類異戊二烯的前體物質異戊酰焦磷酸(isopentenyl?diphosphate，IPP)或二甲烯丙基焦磷酸(dimethylallyl?diphosphate，DMAPP)。該途徑完全不同于哺乳動物和植物胞漿中的甲羥戊酸(MVA)途徑。MEP途徑合成的類異戊二烯及其衍生物在生物代謝和細胞壁合成中至關重要，因此MEP途徑已成為藥靶研究的熱點。將大腸埃希菌或腸沙門菌MEP途徑的某一基因突變或缺失，可引起致死性突變，證實MEP途徑對細菌的生存是必需的。由于MEP途徑在病原體廣泛存在，而不存在于人、動物和植物胞漿中，使得催化該途徑的酶成為潛在的、同時又具有選擇性的分子靶位。?

MEP途徑共包含8個酶參與其中，分別為DXS，IspC，IspD，IspE，IspF，IspG，IspH，Idi。其中ispD(2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphateCytidyltransferase，2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸胞嘧啶轉移酶)為這一途徑中的關鍵基因，負責將MEP和CTP(三磷酸胞苷)催化反應生成CDP-ME(如圖1所示)。Dean?Crick對該基因進行了溫度敏感性突變，證明確實該基因突變結核桿菌無法存活(Hyungjin?Eoh，Amanda?C.Brown，Lori?Buetow，et?al.Brennan，and?Dean?C.Crick.Characterization?of?the?Mycobacterium?tuberculosis4-Diphosphocytidyl-2-C-Methyl-d-Erythritol?Synthase：Potential?for?Drug?Development.J?Bacteriol.2007，189(24)：8922-8927)。但目前尚沒有IspD抑制劑的報道，通過篩選結核桿菌的IspD抑制劑有可能發現全新作用機制的抗結核藥物。?

杜米芬(Domiphen?Bromide，DMB)系陽離子型表面活性廣譜殺菌劑。其適用于口腔、咽喉感染的輔助治療和皮膚、器械消毒等。目前尚沒有杜米芬作為抗結核藥物的報道。?

發明內容

為了篩選IspD抑制劑，本發明以IspD為靶標，利用其酶學活性建立IspD抑制劑篩選模型，并評價篩選產物的抗結核活性，最終發現杜?米芬具有抗結核桿菌活性。具體地，?

本發明的一個方面涉及一種篩選IspD抑制劑的組合試劑，其包括MEP、CTP、IspD和待篩選化合物；還包括酶反應緩沖液和離子試劑，其中所述離子試劑包括MgCl₂、NaF及DTT(二硫蘇糖醇)；此外還包括測定MEP、CTP和IspD反應所生成的PPi的試劑，所述試劑優選為β-巰基乙醇和鉬酸銨。?

其中所述IspD是從能夠產生IspD的生物中提取獲得或者根據上述生物的基因組序列利用分子生物學方法獲得。?