[發明專利]菠蘿中性轉化酶基因Ac-NI1、其編碼蛋白質以及其基因克隆方法

無效

• 申請號: 201010196676.4
• 申請日: 2010-06-08
• 公開（公告）號: CN101899451A
• 公開（公告）日: 2010-12-01
• 發明（設計）人: 杜麗清;張秀梅;孫光明;謝江輝;姚艷麗
• 申請（專利權）人: 中國熱帶農業科學院南亞熱帶作物研究所
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N9/00;C12N15/10
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務所有限公司 44228
• 代理人: 劉廣生

技術領域

本發明涉及一種基因技術，屬于生物技術領域，具體涉及一種菠蘿中性轉化酶基因Ac-NI1、其編碼蛋白質以及其基因克隆方法。

背景技術

轉化酶的分子量大小在50kD至80kD之間，為單體或二聚體，可分為酸性轉化酶(AI)和中性或堿性轉化酶(NI)，催化如下反應：Suc+H₂O←→Fru+Glu。NI大多被認為是一種胞質酶，其最適pH值在7.0左右，也可分為可溶性的和不溶性的兩種，前者分布于細胞質中，后者存在于細胞壁上(Lowell和Tomlinson，1989；Klann等，1996；Xu等，1995)。在L.esculentum番茄果實液泡中有高活性的Ivr，所以液泡中積累了大量的果糖和葡萄糖，蔗糖的含量很少。在L.perur和L.chmielewskii番茄果實中液泡Ivr活性極低，所以在液泡中大量積累蔗糖，而果糖和葡萄糖的含量很少(D’Aoust等，1999)。近年來研究表明，在蘋果(趙智中等，2001)、溫州蜜柑(Beurter，1985)果實的發育早期蔗糖積累受Ivr影響較大，幼果內蔗糖的積累與Ivr的活性呈顯著負相關。‘紐荷爾’臍橙幼果中轉化酶對糖的積累影響較大(王利芬等，2004)。寧夏枸杞果實發育過程中，蔗糖的含量與3種代謝酶均無顯著相關性，己糖的積累與轉化酶活性呈現極顯著的正相關，SS和SPS與這幾種糖均不存在顯著的相關性(鄭國琦等，2008)。楊梅果實發育期間中，轉化酶的變化與蔗糖積累呈負相關(謝鳴等，2005)。可見，Ivr是蔗糖在這些果實內代謝的一個關鍵酶。

目前已從葡萄、桃、櫻桃、蘋果、草莓、甘蔗、柑橘、甜瓜等作物中克隆到相應的轉化酶基因。在模式植物擬南芥中已分離出9個編碼NI的基因(The?Arabidopsis?Genome?Initiative2000)；在水稻中已分離出8個基因編碼NI的基因(International?Rice?Genome?Sequencing?Project2005)。從胡蘿卜中克隆的NI的N-端無信號肽，富含半胱氨酸，且與AI的同源性很低(Lee和Sturm，1996)。從桃中分離出的編碼NI基因的cDNA，命名為PpNI1，長為1578bp，與胡蘿卜中的NI基因的同源性高達84％的，含有NI基因典型的高保守盒，屬于NI基因家族的α亞族(Nonis等，2007)。在甘蔗中分離出的編碼NI的SNI基因片段，含有1.7kb的開放閱讀框，編碼572個氨基酸，分子量約為64.3kDa，等電點為8.57(Bosch等，2004)。從甜菜中分離NI的編碼基因BVInv-N，含有特有的開放閱讀框，編碼617個氨基酸，分子量為69.5KDa，等電點為6.84，在這個基因兩端有兩個特殊區域，5′具有長為197bp的非編碼區，而在3′除含有439bp的非編碼區還有一個poly-A尾巴(Maria-Cruz等，2007)。

轉化酶基因的表達也呈現時空特異性。目前在桃、葡萄、日本梨、胡蘿卜、甘蔗的等作物中已有許多轉化酶基因的相關報道，但在菠蘿上未發現相關研究報道。為此，對菠蘿中性轉化酶基因的克隆以及在不同發育時期的表達進行研究，將有助于弄清菠蘿果實糖積累的分子機理，同時獲得可應用于菠蘿果實品質改良的基因資源。

發明內容

本發明的目的在于提供一種菠蘿果實中性轉化酶基因Ac-NI1的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1，含1034bp。

本發明的另一個目的在于提供一種菠蘿果實中性轉化酶基因Ac-NI1編碼的蛋白序列，含345個氨基酸殘基，含有植物中性轉化酶結構域，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2。

同時，本發明還提供該中性轉化酶基因Ac-NI1的克隆方法。

本發明所提供的中性轉化酶基因，來自菠蘿(Ananas?comosus)，命名為Ac-NI1基因，核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1。

上述菠蘿果實中性轉化酶基因Ac-NI1編碼的蛋白質，來自菠蘿(Ananas?comosus)，命名為Ac-NI1蛋白質，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2。

上述菠蘿果實中性轉化酶基因Ac-NI1的克隆方法，包括如下步驟：

(1)選用菠蘿果實作為實驗材料，采用改良SDS法提取菠蘿果實中的總RNA，RNA含量及質量采用瓊脂糖凝膠電泳檢測；

(2)以獲得的總RNA為模板，采用Takara公司生產的mRNA?Selective?PCR?Kit進行反轉錄獲得cDNA；

(3)根據NCBI數據庫中的EST信息設計菠蘿Ac-NI1基因編碼區引物：