[發(fā)明專利]菠蘿中性轉(zhuǎn)化酶基因Ac-NI1、其編碼蛋白質(zhì)以及其基因克隆方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010196676.4
• 申請日: 2010-06-08
• 公開（公告）號: CN101899451A
• 公開（公告）日: 2010-12-01
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 杜麗清;張秀梅;孫光明;謝江輝;姚艷麗
• 申請（專利權(quán)）人: 中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院南亞熱帶作物研究所
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N9/00;C12N15/10
• 代理公司: 廣州市南鋒專利事務(wù)所有限公司 44228
• 代理人: 劉廣生

1.一種菠蘿中性轉(zhuǎn)化酶基因Ac-NI1，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1。

2.一種權(quán)利要求1所述菠蘿中性轉(zhuǎn)化酶基因Ac-NI1編碼的蛋白質(zhì)，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2。

3.一種權(quán)利要求1所述菠蘿中性轉(zhuǎn)化酶基因Ac-NI1的克隆方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)選用菠蘿果實(shí)作為實(shí)驗材料，采用改良SDS法提取菠蘿果實(shí)中的總RNA，RNA含量及質(zhì)量采用瓊脂糖凝膠電泳檢測；

(2)以獲得的總RNA為模板，采用Takara公司生產(chǎn)的mRNA?Selective?PCR?Kit進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA；

(3)根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫中的EST信息設(shè)計菠蘿Ac-NI1基因編碼區(qū)引物：

正向引物：5’-CAG(T/C)T(T/G/A)CAGAG(C/T)TGGGAGA-3’

反向引物：5’-GTGTC(A/G)TA(A/C)TA(T/C)TCAGGCCA-3’

用第一鏈反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10μl作為PCR的模板，反應(yīng)體系為：10×PCR?Buffer?II?2.5μl、25mM?MgCl₂?1.5μl、10mM?dNTP/analog?Mixture?1μl、ExTaq?0.2μl、上游引物(20μM)1μl、下游引物(20μM)1μl、再補(bǔ)足Rnase?Free?H₂O至總體積25μl；擴(kuò)增程序為：85℃變性1min，54℃復(fù)性1min，72℃延伸2min，30個循環(huán)后，72℃總延伸10min；

(4)PCR產(chǎn)物回收后與pGEM-T?easy?Vector連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli?DH?5α感受態(tài)細(xì)胞，采用藍(lán)白斑法篩選陽性克隆，篩選的陽性克隆經(jīng)PCR進(jìn)一步驗證后測序，獲得Ac-NI1基因。