[發明專利]一種提高綿羊卵母細胞體外利用效率的方法

無效

• 申請號: 201010196378.5
• 申請日: 2010-06-10
• 公開（公告）號: CN101892194A
• 公開（公告）日: 2010-11-24
• 發明（設計）人: 黃俊成;汪立芹;趙云程;劉明軍;林嘉鵬;陳童
• 申請（專利權）人: 新疆維吾爾自治區畜牧科學院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 烏魯木齊新科聯專利代理事務所(有限公司) 65107
• 代理人: 歐詠

技術領域

本發明涉及磷酸二酯酶抑制劑(PDE)milrinone，對經過BCB篩選后的質量不好的BCB陰性卵母細胞進行抑制的方法，能顯著提高綿羊卵母細胞體外成熟率。

背景技術

PDEs是一類能水解細胞內環核苷酸第二信使的同工酶，在哺乳動物中，根據PDE動力學、底物特異性、組織細胞中的分布、抑制劑和激動劑以及氨基酸序列而將其分為11類，PDE3是其中一類。許多研究表明，哺乳動物卵母細胞減數分裂恢復受第二信使cAMP調節，而PDE是調控細胞內cAMP水平的一種關鍵酶，因此PDE能夠阻滯體外培養卵母細胞減數分裂的恢復，在卵母細胞成熟分裂的調控過程中起重要作用。

在前期研究的一種用于綿羊卵母細胞體外的篩選培養方法(專利申請號：200910113567.9)中發現，經過BCB篩選后的陰性卵母細胞成熟率極顯著低于陽性卵母細胞，因而，如何提高陰性卵母細胞質量成為亟待解決的問題。文獻檢索披露：1.Biology?of?Reproduction，69(2003)，2045-2052，作者：D.Nogueira等，發表的《磷酸二酯酶抑制劑3在小鼠體外未成熟卵母細胞發育能力中的作用》文章得出，10μMol/L?PDE3抑制劑短暫阻滯小鼠卵母細胞減數分裂，能促進其發育能力。2.Fertility?and?Sterility，91，5(2009)，2037-2042，作者：Byung?Chul?Jee，M.D.發表的《成熟培養液中磷酸二酯酶抑制劑3對小鼠胚胎發育的作用》文章內容是，比較了1μMol/L、5μMol/L、10μMol/L濃度的PDE3抑制劑分別作用6h和24h，對小鼠卵母細胞的成熟、受精及后期發育沒有影響。3.Biology?of?Reproduction，66(2002)，180-184，作者：Mario?A.Mayes等發表的《PDE3和PDE4在維持牛卵母細胞減數分裂阻滯中的作用》的文章中得出，PDE3在維持牛卵母細胞減數分裂阻滯中起重要作用，而PDE4不起作用。4.Biology?of?Reproduction，74(2006)，177-184，作者：D.Nogueira等發表的《PDE3能提高人卵母細胞體外成熟及后期發育能力》，文章得出：用PDE3抑制的人卵母細胞將近98％阻滯在減數分裂時期，成熟率極顯著高于未抑制組。

國內有廣西大學動物繁殖研究所卞桂華等5人發表的《磷酸二酯酶抑制劑對水牛卵母細胞減數分裂成熟的影響》、內蒙古大學哺乳動物生殖生物學與生物技術教育部重點實驗室周波等4人發表的《磷酸二酯酶亞型抑制劑與細胞周期蛋白抑制劑對綿羊卵母細胞體外成熟的影響》、中國農業大學生物學院卜淑敏等3人發表的《3種磷酸二醋酶對小鼠卵母細胞自發成熟的影響》以及西北農林科技大學生物工程研究所馬利兵等5人發表的《磷酸二酯酶抑制劑對山羊卵母細胞體外成熟及孤雌胚發育的影響》。本發明將PDE3與BCB篩選技術相結合作為本方法的切入點，展開的方法學與應用學的研究，具有重要的實踐意義。

發明內容

本發明的目在于：為提高綿羊卵母細胞的質量，即先采用BCB染色篩選，再對篩選后的質量差的卵母細胞用milrinone進行抑制培養，效果十分明顯，該方法簡單易操作，實用性極強。

本發明的目的是這樣實現的：一種提高綿羊卵母細胞體外利用效率的方法，將染色分離獲取的質次BCB-卵母細胞，用含有50-100μMol/L的PDE3抑制劑milrinone的成熟培養液洗滌2-3次，培養6-9小時，用不含有milrinone的成熟培養液洗滌2-3次，培養至24小時；脫去卵母細胞周圍的顆粒細胞，移至洗滌液內，撿出排出第一極體的卵母細胞，統計極體排除率即成熟率；將排出第一極體的卵母細胞用5μMol/L離子霉素激活4-5分鐘，洗滌液洗滌1-3次，再用2-3小時前在CO₂箱平衡好的2mMol/L?6-甲氨基嘌呤激活2-3小時，用2小時前在CO₂箱平衡好的培養液洗滌3-4次，入培養液內培養48小時后統計卵裂率，168小時后統計囊胚率即可；

其中BCB-卵母細胞的獲取：摘取宰殺30分鐘內的綿羊卵巢，置入溫度在30-35℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml鏈霉素的生理鹽水中，3小時內用生理鹽水清洗3-4次；用吸有1ml抽卵液，帶有9號針頭的10ml注射器抽吸卵巢表面2-8mm大小的卵泡，將注射器內回收的卵泡液打在35-60mm的皿內，在顯微鏡下撿出卵母細胞，放入添加濃度為25-30μMol/L的BCB染色液，至于35-39℃水浴中染色80-90分鐘；在顯微鏡下將BCB+和BCB-卵母細胞分離；