[發(fā)明專利]一種提高綿羊卵母細(xì)胞體外利用效率的方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010196378.5
• 申請日: 2010-06-10
• 公開（公告）號: CN101892194A
• 公開（公告）日: 2010-11-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 黃俊成;汪立芹;趙云程;劉明軍;林嘉鵬;陳童
• 申請（專利權(quán)）人: 新疆維吾爾自治區(qū)畜牧科學(xué)院中國-澳大利亞綿羊育種研究中心
• 主分類號: C12N5/075
• 分類號: C12N5/075
• 代理公司: 烏魯木齊新科聯(lián)專利代理事務(wù)所(有限公司) 65107
• 代理人: 歐詠

1.一種提高綿羊卵母細(xì)胞體外利用效率的方法，其特征在于：將染色分離獲取的質(zhì)次BCB-卵母細(xì)胞，用含有50-100μMol/L的PDE3抑制劑milrinone的成熟培養(yǎng)液洗滌2-3次，培養(yǎng)6-9小時，用不含有milrinone的成熟培養(yǎng)液洗滌2-3次，培養(yǎng)至24小時；脫去卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞，移至洗滌液內(nèi)，撿出排出第一極體的卵母細(xì)胞，統(tǒng)計極體排除率即成熟率；將排出第一極體的卵母細(xì)胞用5μMol/L離子霉素激活4-5分鐘，洗滌液洗滌1-3次，再用2-3小時前在CO₂箱平衡好的2mMol/L?6-甲氨基嘌呤激活2-3小時，用2小時前在CO₂箱平衡好的培養(yǎng)液洗滌3-4次，入培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)48小時后統(tǒng)計卵裂率，168小時后統(tǒng)計囊胚率即可；

其中BCB-卵母細(xì)胞的獲取：摘取宰殺30分鐘內(nèi)的綿羊卵巢，置入溫度在30-35℃，含1000IU/ml青霉素和1000IU/ml鏈霉素的生理鹽水中，3小時內(nèi)用生理鹽水清洗3-4次；用吸有1ml抽卵液，帶有9號針頭的10ml注射器抽吸卵巢表面2-8mm大小的卵泡，將注射器內(nèi)回收的卵泡液打在35-60mm的皿內(nèi)，在顯微鏡下?lián)斐雎涯讣?xì)胞，放入添加濃度為25-30μMol/L的BCB染色液，至于35-39℃水浴中染色80-90分鐘；在顯微鏡下將BCB+和BCB-卵母細(xì)胞分離；

其中染色分離的BCB+卵母細(xì)胞用成熟培養(yǎng)液洗滌2-3次，培養(yǎng)至24小時，直接利用即可；

其中實驗液體的配制：

抽卵液：TCM199-hepes+1mg/ml?PVA+0.7mg/ml肝素鈉；

亮甲酚藍(lán)染色液：26μMol/L亮甲酚藍(lán)+PBS+5mg/ml?BSA；

含有milrinone的成熟培養(yǎng)液：50-100μMol/L?milrinone+TCM199-HCO₃+10％FBS+0.05IU/ml?FSH+0.05IU/ml?LH+1μg/ml?estradiol+24.2μg/ml丙酮酸鈉+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml?EGF+100IU/ml雙抗；

成熟培養(yǎng)液：TCM199-HCO₃+10％FBS+0.05IU/ml?FSH+0.05IU/ml?LH+1μg/mlestradiol+24.2μg/ml丙酮酸鈉+0.1mM/L半胱氨酸+10ng/ml?EGF+100IU/ml雙抗；

洗滌液：10％FBS+90％TCM199-hepes；

SOF：6.29mg/ml?NaCL+0.534mg/ml?KCL+0.162mg/ml?KH₂PO₄+0.6μl/ml乳酸鈉+0.089mg/mlMgSO₄+2.1mg/mlNaHCO₃+0.0357mg/ml丙酮酸鈉+0.299mg/mlCaCL₂·2H₂O；

培養(yǎng)液：SOF+3mg/mlBSA；

離子霉素：5μMol/L離子霉素+1％二甲基亞砜+10％胎牛血清+89％TCM199-hepes；

6-甲氨基嘌呤：2mMol/L?6-甲氨基嘌呤+1％二甲基亞砜+10％胎牛血清+89％TCM199-HCO₃。

2.按照權(quán)利要求1所述的提高綿羊卵母細(xì)胞質(zhì)量的方法，其特征在于：顯微鏡下的著藍(lán)色的卵母細(xì)胞被設(shè)為BCB+，沒著藍(lán)色的卵母細(xì)胞設(shè)為BCB-，BCB-的卵母細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)量顯著低于BCB+。

3.按照權(quán)利要求1所述的提高綿羊卵母細(xì)胞質(zhì)量的方法，其特征在于：脫去卵母細(xì)胞周圍的顆粒細(xì)胞，是將卵母細(xì)胞置于濃度為0.1％的透明質(zhì)酸酶溶液內(nèi)，經(jīng)反復(fù)吹吸即可。

4.按照權(quán)利要求1所述的提高綿羊卵母細(xì)胞質(zhì)量的方法，其特征在于：所用試劑均為專項訂購或市售產(chǎn)品。