[發明專利]一種與PHBV的3-HV單體合成相關的β-酮硫解酶及其編碼基因與應用

有效

• 申請號: 201010195738.X
• 申請日: 2010-06-01
• 公開（公告）號: CN102268424A
• 公開（公告）日: 2011-12-07
• 發明（設計）人: 向華;馮博;韓靜
• 申請（專利權）人: 中國科學院微生物研究所
• 主分類號: C12N9/88
• 分類號: C12N9/88;C12N15/60;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12P7/62;C12P7/42;C12R1/01
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;任鳳華

技術領域

本發明涉及一種極端嗜鹽古菌中與可降解材料PHBV的3-HV單體合成相關的β-酮硫解酶的研究與應用。

背景技術

許多原核生物包括細菌和某些極端嗜鹽古菌，在碳源過量，氮、磷、硫、氧等元素限制的培養條件下，胞內可以積累聚羥基脂肪酸酯(PHA)。PHA是一類由3-羥基脂肪酸(3HA)組成的生物聚酯，主要作為碳源、能源及還原力的貯藏性物質。PHA具有與傳統的石油化工塑料如聚乙烯、聚丙烯相類似的物化性質，并且它具有可完全生物降解和利用可再生資源合成的特點，被認為是一種環境友好型的“生物可降解塑料”，可以從一定程度上緩解石油塑料引起的“白色污染”問題。PHA目前已知的應用領域包括可生物降解包裝材料，手術縫合線、藥物釋放載體、聚合物支架等醫用材料以及其手性單體在藥物合成過程中的應用等。

在各種PHA中，由于生產成本的限制，目前只有PHB(聚羥基丁酸酯)與PHBV(聚羥基丁酸羥基戊酸酯)在細菌中實現了半商業化的生產。PHB是PHA家族中最簡單、研究最透徹的成員。盡管其性質類似于熱塑性塑料，但是PHB具有易碎、熱穩定性不高、可塑性和機械性能較差等缺點，因而限制了它的廣泛應用。與PHB相比，PHBV由于3-羥基戊酸(3-HV)單體的摻入，其性能有了很大的改進，因此具有更加廣泛的應用前景。但是，用細菌來生產PHBV需要添加昂貴的丙酸、戊酸等相關底物來提供3-HV單體，而且高濃度的相關底物會抑制菌體的生長。與細菌相比，極端嗜鹽古菌作為PHA的生產菌株可以在很大程度上降低其生產成本，可以在不添加有機酸等相關碳源的情況下合成PHBV，并且所合成的PHBV在性能上要優于細菌來源的PHBV。

細菌中，上述兩種短鏈PHA的生物合成是通過β-酮硫解酶(PhaA)，β-酮酯酰-CoA還原酶(PhaB)和PHA合酶(PhaC)所催化。β-酮硫解酶與β-酮酯酰-CoA還原酶負責提供PHA合成的前體3-HB-CoA和3-HV-CoA。目前，國際上對極端嗜鹽古菌PHA的研究還主要集中在發酵工藝的優化方面，而對此類微生物中PHA合成相關基因的研究相對較少，在公開報道中未見嗜古鹽菌PHA合成相關的β-酮硫解酶(PhaA)的報道，更無類似于細菌中對這些相關基因通過基因工程技術進行改造，尋求性能更加優良的PHA以及實現PHA的低成本生產的報道。因此，極端嗜鹽古菌中β-酮硫解酶基因的發現、及其在極端嗜鹽古菌中的遺傳工程技術的改造，對于極端嗜鹽古菌PHA的生物工程開發具有非常重要的意義。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種與PHBV的3-HV單體合成相關的β-酮硫解酶及其編碼基因。

本發明提供的蛋白質，名稱為PhaAl，來源于極端嗜鹽古菌(Haloferax?sp.)XH1001CGMCC?No.3822，蛋白質：

1)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

2)將序列1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與聚羥基丁酸羥基戊酸酯(PHBV)合成和/或3-羥基脂肪酸(3-HV)合成相關的由1)衍生的蛋白質。

上述一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加是指不超過10個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

其中，序列表中序列1由383位氨基酸殘基組成。

上述蛋白的編碼基因(phaA1)也屬于本發明的保護范圍。

所述編碼基因為如下1)、2)、3)或4)的所示的基因：

1)序列表中序列2自5’末端第955-2106位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2自5’末端第791-2119位核苷酸所示的DNA分子；

3)在嚴格條件下可以與1)或2)限定的DNA分子雜交且與聚羥基丁酸羥基戊酸酯合成和/或3-羥基脂肪酸合成相關蛋白的DNA分子；

4)與1)或2)限定的DNA序列至少具有90％同源性，且編碼與聚羥基丁酸羥基戊酸酯合成和/或3-羥基脂肪酸合成相關蛋白的DNA分子。

所述嚴格條件可為在0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液中，在65℃下雜交，并用該溶液洗膜。

其中，序列表中序列2是由2995個脫氧核苷酸組成，開放閱讀框為自5′末端第955-2106位核苷酸序列，自5′末端第2104-2106位核苷酸序列為phaA1的終止密碼子，編碼具有序列表中序列1的氨基酸殘基序列；自5′末端第914-954位核苷酸序列為所述編碼基因的啟動子區域，其中第924-931位核苷酸序列為啟動子核心序列。