[發(fā)明專利]一種dhfr互補表達的共轉(zhuǎn)染真核表達載體及其制備方法與應(yīng)用有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201010194400.2 | 申請日： | 2010-06-08 |
| 公開（公告）號： | CN102277380A | 公開（公告）日： | 2011-12-14 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 王晶翼;史文龍;王慶民;孫麗霞;閻巖;張瑩寬;陸貴全 | 申請（專利權(quán)）人： | 齊魯制藥有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/85 | 分類號： | C12N15/85;C12N15/66;C12N5/10;C12P21/00 |
| 代理公司： | 濟南金迪知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37219 | 代理人： | 趙會祥 |
| 地址： | 250100 山東*** | 國省代碼： | 山東;37 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 dhfr 互補 表達 轉(zhuǎn)染 載體 及其 制備 方法 應(yīng)用 | ||
1.一種dhfr互補表達的共轉(zhuǎn)染真核表達載體，其特征在于，在pCI-neo質(zhì)粒中分別插入了核基質(zhì)附著區(qū)域，土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列，核糖體進入位點序列，dhfr1-105aa基因片段或dhfr106-187aa基因片段。
2.如權(quán)利要求1所述的共轉(zhuǎn)染真核表達載體，其特征在于，在pCI-neo質(zhì)粒相鄰的兩個酶切位點SacII和BglII之間插入了核基質(zhì)附著區(qū)域；在pCI-neo質(zhì)粒相鄰的兩個酶切位點SalI和NotI之間插入了土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示；在pCI-neo質(zhì)粒相鄰的兩個酶切位點MluI和XbaI之間插入了核糖體進入位點序列，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.6所示；在pCI-neo質(zhì)粒相鄰的兩個酶切位點XbaI和SalI之間插入了dhfr1-105aa基因片段或dhfr106-187aa基因片段，dhfr1-105aa基因片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示，dhfr106-187aa基因片段的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示。
3.如權(quán)利要求1所述的共轉(zhuǎn)染真核表達載體，其特征在于，上述dhfr1-105aa基因片段和dhfr106-187aa基因片段的5’端連接有亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)編碼基因序列；所述的編碼亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示。
4.如權(quán)利要求1所述的共轉(zhuǎn)染真核表達載體，其特征在于，所述的核基質(zhì)附著區(qū)域為人β-globin核基質(zhì)附著區(qū)域，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。
5.權(quán)利要求1-4任意之一所述dhfr互補表達的共轉(zhuǎn)染真核表達載體的制備方法，步驟如下：
(1)用限制性內(nèi)切酶SacII和BglII雙酶切pCI-neo質(zhì)粒，插入經(jīng)限制性內(nèi)切酶SacII和BglII雙酶切的核基質(zhì)附著區(qū)域(MAR)，構(gòu)建質(zhì)粒pCIneo-M；
(2)用限制性內(nèi)切酶SalI和NotI雙酶切步驟(1)制得的質(zhì)粒pCIneo-M，插入經(jīng)限制性內(nèi)切酶SalI和NotI雙酶切的土撥鼠肝炎病毒轉(zhuǎn)錄后調(diào)控序列(WPRE)，構(gòu)建質(zhì)粒pCIneo-MW；
(3)用限制性內(nèi)切酶MluI和XbaI雙酶切步驟(2)制得的質(zhì)粒pCIneo-MW，插入經(jīng)限制性內(nèi)切酶MluI和XbaI雙酶切的核糖體進入位點序列(IRES)，構(gòu)建質(zhì)粒pCIneo-MWI；
(4)用限制性內(nèi)切酶BglII和SalI雙酶切dhfr1-105aa基因片段或dhfr106-187aa基因片段，用限制性內(nèi)切酶BamHI和SalI雙酶切亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)編碼基因序列，構(gòu)建LZ-dhfr(1-105aa)或LZ-dhfr(106-187aa)；
(5)用限制性內(nèi)切酶XbaI和SalI雙酶切步驟(3)制得的質(zhì)粒pCIneo-MWI，插入經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaI和SalI雙酶切的經(jīng)步驟(4)構(gòu)建的LZ-dhfr1-105aa基因片段或經(jīng)限制性內(nèi)切酶XbaI和SalI雙酶切的經(jīng)步驟(4)構(gòu)建的LZ-dhfr106-187aa基因片段，構(gòu)建共轉(zhuǎn)染真核表達載體pCIneo-MWLD1或共轉(zhuǎn)染真核表達載體pCIneo-MWLD2。
6.權(quán)利要求1-4任意之一所述dhfr互補表達的共轉(zhuǎn)染真核表達載體在真核細胞中高水平表達目的蛋白中的應(yīng)用。
7.如權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的目的蛋白為免疫球蛋白、免疫球蛋白融合蛋白、生長因子、可溶性受體或血液凝集因子之一。
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