[發明專利]一種dhfr互補表達的共轉染真核表達載體及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201010194400.2
• 申請日: 2010-06-08
• 公開（公告）號: CN102277380A
• 公開（公告）日: 2011-12-14
• 發明（設計）人: 王晶翼;史文龍;王慶民;孫麗霞;閻巖;張瑩寬;陸貴全
• 申請（專利權）人: 齊魯制藥有限公司
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/66;C12N5/10;C12P21/00
• 代理公司: 濟南金迪知識產權代理有限公司 37219
• 代理人: 趙會祥

技術領域

本發明涉及一種真核表達載體，具體涉及一種可高表達抗體及其他目的蛋白的高效真核表達載體及其制備方法與應用，屬于生物技術技術領域。

背景技術

目前以哺乳動物為代表的真核細胞表達系統的開發是生物制藥產業的發展趨勢。相對于大腸桿菌(原核細胞)表達系統，采用哺乳動物細胞表達既能保證重組蛋白質二硫鍵的正確配對和蛋白質折疊，又能保證蛋白質的糖基化，從而使由哺乳動物細胞表達的重組蛋白與天然蛋白在結構和功能上保持很高的一致性。發達國家藥物市場中，通過哺乳類動物細胞培養表達的生物藥物已達到各類生物藥物總數的60％左右，市場份額已接近70％。哺乳動物細胞高效表達和大規模培養技術已成為當今生物制藥領域最重要的關鍵技術之一。

在哺乳動物細胞中基因的高表達依賴于許多因素，包括轉錄、翻譯控制元件、RNA代謝、基因拷貝數、mRNA穩定性、基因在宿主細胞染色體上的定位等。目前抗體真核表達載體構建主要基于兩種策略：一是將輕鏈和重鏈分別克隆到兩個真核表達載體上，共轉染于哺乳動物細胞中，從而表達出完整抗體；二是將重鏈和輕鏈分別連接到一個具有雙向啟動子的真核表達載體的啟動子之后，或順序性連接在同一真核表達載體的一個啟動子上，然后再轉染到哺乳動物細胞中表達。在真核表達體系中，載體的構建和宿主細胞的選擇對于決定表達量的高低是至關重要的。基于對真核表達調控的認識，一個好的真核表達載體至少要具備以下幾個特征：①具有一個或多個組成型或誘導型的強啟動子，例如cmv5、EF1?α等；②真核細胞選擇性的mRNA翻譯及翻譯后加工信號，包括Kozak序列、翻譯終止密碼子、mRNA切割及加尾信號、mRNA剪切信號等；③具有轉錄終止子；④具有原核啟動子和篩選標志(如抗生素等)以便于載體在細菌中擴增；⑤必須具備真核表達篩選標志，這些標志包括穩定轉染細胞株的篩選標志如G418、Zeocin等，還有基因擴增標志如DHFR(二氫葉酸還原酶)、GS(谷氨酸合成酶)，兩者原理相似，都既可以作為轉染陽性細胞的篩選標志，又可擴增目的基因。

由于商品化的真核表達載體未能有效整合調控元件，難以獲得高表達的細胞株。因此，在表達載體中加入有助于提高表達量的基因元件是必須的。在CHO細胞表達系統中，高水平表達重組蛋白的細胞株的獲得常常比較困難。最主要的因素是表達外源蛋白的細胞比率低和細胞培養過程中外源基因不穩定。另外，獲得高表達的細胞株往往需要進行大量的細胞篩選工作，其中單克隆的篩選和氨甲喋呤(MTX)加壓篩選過程需要耗費大量的時間。

針對哺乳動物細胞表達的這些缺點，選擇使用基因表達的調控元件，可以提高抗體表達量并能在短期內完成對重組細胞株的表達評價，獲得可高水平表達目的蛋白的細胞株。

將外源蛋白基因整合到細胞染色體上的主要問題是基因整合位點不同，蛋白表達差異很大。事實上，外源蛋白的表達大都受到抑制，這主要是由于其周圍染色體結構的影響。真核染色體的結構高度有序，可以將基因組分成不同的區域發揮各自獨立的轉錄功能。這些區域與核骨架聯系緊密，是DNA結合位點，稱為核基質附著區域(MAR)。MAR序列富含AT堿基(含量約70％)，與拓撲異構酶II多數序列相似。在許多表達體系中將MAR序列與真核啟動子連在一起，可以提高基因表達水平并減少位置效應。Jong-Mook?Kim等擴增了人β-globinMAR、人干擾素β-SAR、人CSP-BSAR、DHFR內含子SAR、人HPRT?MAR、雞溶菌酶MAR和雞胚α-globin?MAR，并將這些MAR分別構建到質粒上，進行外源蛋白的表達比較。結果顯示人β-globin?MAR對于外源蛋白的影響效果最好：將表達外源蛋白的細胞比率提高了2.5倍，約75％的單克隆為陽性細胞；提高外源基因拷貝數，從而提高表達水平7.5倍；去除單克隆篩選步驟，通過細胞群落集體兩輪MTX加壓(50nM、1μM)，即可得到穩定表達目的蛋白的細胞集落，大大縮短實驗時間。因此用這種表達系統可以在短時間內獲得高表達目的蛋白的細胞株。

通常用于基因擴增的DHFR基因從結構上可分為2個部分：F[1，2]和F[3]，分別編碼DHFR1-105aa和DHFR106-187aa。DHFR兩部分的N端通過(Gly·Gly·Gly·Gly·Ser)2的10個氨基酸的Linker連接亮氨酸拉鏈結構(GCN4?Leucine?Zipper)，可構建互補表達載體。即一個載體只含有DHFR的一部分(DHFR1-105?aa或DHFR106-187?aa)，與對應的另一個載體形成互補。在細胞基因表達時，DHFR片段通過亮氨酸拉鏈結構的幫助，重新結合成為完整的DHFR分子，發揮其生物學效應，見附圖1。