[發明專利]表達抗炎細胞因子IL-10的骨髓源神經干細胞的制備方法

無效

• 申請號: 201010193792.0
• 申請日: 2010-06-08
• 公開（公告）號: CN101914492A
• 公開（公告）日: 2010-12-15
• 發明（設計）人: 楊靜嫻;王東;孟憲生;康廷國;徐志立
• 申請（專利權）人: 遼寧中醫藥大學
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/0797;C12N15/63;C12N5/10
• 代理公司: 沈陽利泰專利商標代理有限公司 21209
• 代理人: 劉忠達

技術領域：

本發明涉及一種骨髓來源的、可表達抗炎細胞因子IL-10的新型神經干細胞系的建立方法，及此種將細胞替代與基因治療結合為一體的新型神經干細胞對多發性硬化的治療作用。

背景技術：

神經干細胞(Neural?stem?cell，NSCs)是指具有自我更新能力、并能分化為神經元和神經膠質細胞(少突膠質、星形膠質細胞)的一組細胞群。近年來許多學者用神經干細胞移植治療多發性硬化(multiple?sclerosis，MS)、帕金森氏病、阿爾茨海默病等神經系統疾病及神經損傷，取得了顯著治療效果。但該神經干細胞來源于胚胎或成體動物的側腦室周圍和海馬等區域，取材困難、損傷較大，胚胎來源的神經干細胞無法回避免疫排斥和道德倫理等問題，降低了臨床治療的可行性^[1-3]。因此，尋找取材方便、來源豐富、無免疫排斥的神經干細胞的新來源具有重要的意義。骨髓間充質干細胞具有較強的自我更新和多分化潛能，在一定條件下可分化為神經干細胞^[4-5]，且取材容易，可直接抽取病人骨髓、經體外分選而獲得，無免疫原性，來源豐富穩定，因而日漸受到人們的重視，可成為神經干細胞臨床應用的一個理想的新來源。

多發性硬化(multiple?sclerosis，MS)是一種常見的由自身免疫反應介導的中樞神經系統炎性脫髓鞘疾病。病灶多發于腦和脊髓的白質，呈多灶性炎性細胞侵潤、脫髓鞘及神經元損傷，可導致感覺、運動、意識和神經認知等多方面的功能障礙。該病多發于20-40歲的青壯年人，復發率和致殘率高，是青壯年人非外傷性神經殘疾最常見的原因，迄今為止還無法治愈^[6-7]。

神經干細胞的發現及成功分離，為MS患者的治療帶來了新的希望。本發明以自體骨髓為來源的神經干細胞移植入體內后，能與腦源神經干細胞一樣遷移、整合入CNS病變部位，分化為神經元及少突膠質細胞，成為髓鞘修復和神經元再生的潛在來源。但由于其抗炎作用較弱，不能解除中樞持續性炎癥對髓鞘和神經元的損傷，因此治療效果不十分理想。為增強其療效，我們選擇了白細胞介素10(IL-10)，將其基因轉入骨髓源神經干細胞(Bone?Marrow-NSCs，BM-NSCs)。IL-10是一種抗炎細胞因子，主要由Th2類細胞產生，可抑制T細胞增殖分化，抑制單核細胞、巨噬細胞和NK細胞的生物學活性，抑制Th1細胞產生致炎細胞因子IL-2、IFN-γ等^[3，8]。表達IL-10的新型BM-NSCs靜脈移植后不僅可在外周及中樞發揮抗炎?作用，保護中樞病變區的神經細胞免受或減輕炎癥反應的損害，維持神經元的存活與髓鞘的完整性，而且還能促進神經干細胞分化為髓鞘修復與再生所必需的少突膠質細胞，抑制形成MS病灶斑塊的星形膠質細胞增生，發揮神經修復/保護和免疫調節的雙重作用，使療效顯著增強。

綜上所述，本發明以自體骨髓為來源的神經干細胞不僅是一種理想的、無限制的神經干細胞的新來源，還是基因治療的良好載體，可將細胞替代和基因治療有機地結合為一體，為多發性硬化及其它神經系統疾病的治療提供了一種全新的途徑，具有十分廣闊的開發和應用前景。

發明內容：

本發明的目的在于提供一種來源于骨髓、可表達抗炎細胞因子IL-10的新型神經干細胞的制備方法，用于治療MS及其它多種神經系統疾病。為達到上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種表達抗炎細胞因子IL-10的骨髓源神經干細胞的制備方法，包括下述步驟：

一、小鼠骨髓源神經干細胞的生成與鑒定：

1、提取成年小鼠全骨髓細胞，用微珠標記抗體及磁性細胞分選儀(MiltenyiBiotec)篩選出間充質干細胞[lineage-/CD117(c-kit)⁺]，體外用bFGF和EGF誘導分化為神經干細胞，經免疫組化染色、熒光顯微鏡檢測，證實與腦源神經干細胞(SVZ-NSCs)具有相同的細胞表型，都表達Nestin與SOX2，可鑒定為未分化神經干細胞。見附圖1。

2、體外自我更新與分化能力的檢測：繪制生長曲線，檢測其自我更新能力；以維甲酸(RA)和BDNF為誘導劑，體外誘導分化2周，免疫組化檢測NF-M、NG2、GFAP的表達。結果證實BM-NSCs與SVZ-NSCs具有相同的自我更新與分化為神經元和神經膠質細胞的能力。見附圖2。

二、構建IL-10和EGFP共表達的質粒、轉染骨髓源神經干細胞及檢測IL-10的表達：