[發(fā)明專利]表達抗炎細胞因子IL-10的骨髓源神經干細胞的制備方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010193792.0
• 申請日: 2010-06-08
• 公開（公告）號: CN101914492A
• 公開（公告）日: 2010-12-15
• 發(fā)明（設計）人: 楊靜嫻;王東;孟憲生;康廷國;徐志立
• 申請（專利權）人: 遼寧中醫(yī)藥大學
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;C12N5/0797;C12N15/63;C12N5/10
• 代理公司: 沈陽利泰專利商標代理有限公司 21209
• 代理人: 劉忠達

1.表達抗炎細胞因子IL-10的骨髓源神經干細胞的制備方法，包括如下步驟：

1)、骨髓源神經干細胞的生成與培養(yǎng)：取8-12周C57BL/6小鼠的腓骨，提取全骨髓細胞，用德國美天旎公司的微珠標記抗體及磁性細胞分選儀分兩步篩選出間充質干細胞；首先用系別細胞去除試劑盒去除成熟造血細胞，包括T細胞、B細胞、單核/巨噬細胞、粒細胞和紅細胞以及定向祖細胞CD5⁺，CD45⁺，CD11b⁺，Gr-1⁺，TER119⁺，7/4⁺，保留系別陰性細胞；再用抗CD117微篩選出lineage^-/CD117(c-kit)⁺間充質干細胞，以1×10⁵/ml密度置于DMEM/F12+bFGF?20ug/ml+EGF?20ug/ml+2％B27中培養(yǎng)，每隔3天換液一次，3-5周后誘導形成神經干細胞球；

2)、腦源神經干細胞的體外培養(yǎng)：分離上述小鼠腦組織SVZ區(qū)，切成1cm³小塊，胰蛋白酶消化20min、70μm細胞濾網過濾，將提取出的細胞以1×10⁵/ml密度加入DMEM/F12+bFGF?20ug/ml+EGF?20ug/ml+2％B27中體外培養(yǎng)，1-2周后形成神經干細胞球；

3)、取第三代神經干細胞球及打散的單個神經干細胞，以抗小鼠Nestin和SOX2抗體進行免疫組化染色、熒光顯微鏡檢測；結果顯示BM-NSCs與SVZ-NSCs都為Nestin和SOX2陽性，可鑒定為未分化NSCs；

4)、骨髓源與腦源神經干細胞的自我更新與分化能力的比較，證實兩者具有相同的自我更新與分化能力，都能分化為神經元與神經膠質細胞；方法如下：

①、生長曲線測定：取第三代BM-與SVZ-NSCs神經球，打散成單細胞，以相同細胞密度置于DMEM/F12+bFGF?20ug/ml+EGF?20ug/ml+2％B27中培養(yǎng)；第5，9，13，16天分別取出，分散為單細胞，計數，繪制生長曲線；結果顯示：BM-與SVZ-NSCs增值速度無顯著差別；

②、體外分化實驗：將上述兩種神經球打散成單細胞，加入DMEM/F12+維甲酸15ug/ml+腦源性神經營養(yǎng)因子20ug/ml中體外誘導分化；兩周后免疫組化鑒定，證實BM-NSCs與SVZ-NSCs都分化為神經元NF-M⁺、少突膠質細胞前體細胞NG2⁺、星形膠質細胞GFAP⁺，少數細胞仍維持于未分化狀態(tài)Nestin⁺。