[發明專利]農桿菌介導對麻風樹進行基因轉化的方法

有效

• 申請號: 201010193714.0
• 申請日: 2010-06-07
• 公開（公告）號: CN101857875A
• 公開（公告）日: 2010-10-13
• 發明（設計）人: 李耿光;孫懷娟;王梅珍;李凝
• 申請（專利權）人: 普羅米綠色能源(深圳)有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 深圳市維邦知識產權事務所 44269
• 代理人: 王昌花

1.農桿菌介導對麻風樹進行基因轉化的方法，包括以下步驟：

(1)制備麻風樹外植體以及農桿菌液，外植體經農桿菌浸染后進行共培養；

(2)共培養后的外植體接入篩選培養基進行培養，從而獲得抗性愈傷組織，所述篩選培養基含有1-3mg/L草胺磷或1-10mg/L潮霉素；

(3)分化出不定芽；以及

(4)生根培養，從而獲得轉基因植株。

2.如權利要求1所述的農桿菌介導對麻風樹進行基因轉化的方法，其特征在于：所述第(1)步驟中，共培養所用培養基含有50-200μM乙酰丁酰酮。

3.如權利要求2所述的農桿菌介導對麻風樹進行基因轉化的方法，其特征在于：所述第(1)步驟中，共培養采用C13A固體培養基，其含有1.0-3.0mg/L

6-芐基嘌呤，0.25-1.0mg/L?3-吲哚丁酸，以及50-200μM乙酰丁酰酮的MS培養基；麻風樹外植體的制備經由以下工藝：挑選麻風樹種子經消毒后，取出完整的胚和子葉，于MS培養基萌發，獲得子葉，切制成外植體；農桿菌菌液是用C?13A液體培養基重懸浮離心收集的農桿菌體制得。

4.如權利要求3所述的農桿菌介導對麻風樹進行基因轉化的方法，其特征在于：所述第(1)步驟中，獲得麻風樹外植體工藝中，接種于MS培養基萌發，是將接好的材料先暗培養2-4天，然后光照培養10-12天，種子萌發的培養條件是，溫度23-26℃，光照12-16小時/天，光照強度1800-2000lx；所述第(1)步驟中，農桿菌菌液的準備、浸染及共培養，進一步包括以下工藝步驟：

(a)挑取農桿菌的單克隆于含有抗生素的YEP液體培養基中，28℃，200rpm震蕩培養20-24小時，然后按照1∶100轉接，震蕩培養至對數生長期，OD600＝0.8-1.0，將菌液轉入50ml離心管，常溫，4000rpm離心20分鐘收集菌體，用C13A液體培養基重新懸浮農桿菌，調至OD600＝0.3-0.6，28℃震蕩培養1-2個小時，備用；

(b)將切好的葉片放入容器中，加入準備好的菌液，置于搖床慢速震蕩5-15分鐘；以及

(c)取出浸染過的材料，倒掉菌液，將葉片放在濾紙上，吸去多余的菌液，接入C13A固體培養基，置于23-26℃黑暗共培養2-4天。

5.如權利要求1所述的農桿菌介導對麻風樹進行基因轉化的方法，其特征在于：所述第(2)步驟的篩選培養基為C13PC培養基，其含有1.0-3.0mg/L?6-芐基嘌呤，0.25-1.0mg/L?3-吲哚丁酸，1-3mg/L草胺磷或1-10mg/L潮霉素，250-500mg/L頭孢噻肟鈉的MS培養基。

6.如權利要求5所述的農桿菌介導對麻風樹進行基因轉化的方法，其特征在于：所述第(2)步驟進一步包括以下工藝步驟：

(a)取出共培養后的外植體，放入容器中，加入無菌水洗后，用含250-500mg/L頭孢霉素的無菌水洗；

(b)洗過的外植體放在濾紙上，吸去多余的水，接入篩選培養基C13PC，所述篩選培養基C?13PC是指MS培養基含1.0-3.0mg/L?6-芐基嘌呤，0.25-1.0mg/L

3-吲哚丁酸，1-3mg/L草胺磷或1-10mg/L潮霉素，250-500mg/L頭孢噻肟鈉，2-3％蔗糖，0.7％瓊脂，以及pH5.8-6.0)；以及

(c)置于23-26℃暗培養14-21天，獲得抗性愈傷組織。

7.如權利要求1所述的農桿菌介導對麻風樹進行基因轉化的方法，其特征在于：所述第(3)步驟，是將獲得的抗性愈傷組織，轉入分化培養基SR13PC進行培養，該分化培養基含1-3mg/L草胺磷或1-10mg/L潮霉素。

8.如權利要求7所述的農桿菌介導對麻風樹進行基因轉化的方法，其特征在于：所述第(3)步驟的分化培養基為SR13PC培養基，是MS培養基含0.25-2.0mg/L?6-芐基嘌呤，0.1-1.0mg/L?3-吲哚丁酸，0.01-0.2mg/L赤霉素，1-3mg/L草胺磷或1-10mg/L潮霉素，250-500mg/L頭孢霉素，20-30g/L蔗糖，7g/L瓊脂，以及pH5.8-6.0；接好的抗性愈傷組織在23-26℃，光照培養10-60天即可得到不定芽，培養條件為，光照12-16小時/天，光照強度1800-2000lx。