[發(fā)明專利]農(nóng)桿菌介導(dǎo)對(duì)麻風(fēng)樹進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010193714.0
• 申請(qǐng)日: 2010-06-07
• 公開（公告）號(hào): CN101857875A
• 公開（公告）日: 2010-10-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李耿光;孫懷娟;王梅珍;李凝
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 普羅米綠色能源(深圳)有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/82
• 分類號(hào): C12N15/82;A01H4/00;A01H5/00
• 代理公司: 深圳市維邦知識(shí)產(chǎn)權(quán)事務(wù)所 44269
• 代理人: 王昌花

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及麻風(fēng)樹的組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域及基因工程領(lǐng)域，尤其是指農(nóng)桿菌介導(dǎo)對(duì)麻風(fēng)樹進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的方法，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。

背景技術(shù)

麻風(fēng)樹(Jatopha?curcas)，又名小桐子、柴油樹，為大戟科麻風(fēng)樹屬，多年生落葉灌木或小喬木，分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)。它為喜光陽(yáng)性植物，根系粗壯發(fā)達(dá)，具有較強(qiáng)的耐干旱瘠薄能力，可以種植在其他植物不易生長(zhǎng)的土地上，是干旱地區(qū)理想的造林樹種。麻風(fēng)樹種仁含油量高達(dá)50％～60％，可以提煉出不含硫、無(wú)污染、符合歐四排放標(biāo)準(zhǔn)的生物柴油，是世界公認(rèn)的生物能源樹；也可作藥用，常用于清熱解毒，消腫散瘀等；近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，該植物還具有顯著的抗癌活性。因此麻風(fēng)樹具有廣泛的開發(fā)利用價(jià)值。

目前，我國(guó)在麻風(fēng)樹育種方面的工作才剛剛開始。由于麻風(fēng)樹多為野生狀態(tài)，又為木本植物，采用常規(guī)育種來(lái)改變其遺傳性狀十分困難。因此，采用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，如轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行輔助育種成為首選。植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)的前提是高效的離體再生系統(tǒng)。近些年來(lái)，麻瘋樹組織培養(yǎng)技術(shù)也獲得成功，采用的外植體有種胚、子葉、上胚軸、下胚軸、葉柄、葉片，胚乳，花藥，甚至老齡樹(20年以上)長(zhǎng)出的幼嫩莖段，然而再生頻率有待進(jìn)一步提高。

植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)因能主動(dòng)導(dǎo)入外源基因，定向改造植物性狀日益受到人們的重視。植物遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)可分為兩大類：一類是直接基因轉(zhuǎn)移技術(shù)，包括基因槍法、原生質(zhì)體法、脂質(zhì)體法、花粉管通道法、電激轉(zhuǎn)化法、PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)化方法等，其中基因槍轉(zhuǎn)化法是代表；另一類是生物介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，主要有農(nóng)桿菌介導(dǎo)和病毒介導(dǎo)兩種轉(zhuǎn)化方法。以根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物遺傳轉(zhuǎn)化是目前最有效的途徑之一。然而，由于麻風(fēng)樹的遺傳轉(zhuǎn)化研究起步較晚，因此，對(duì)麻風(fēng)樹進(jìn)行遺傳改良，通過(guò)導(dǎo)入外源基因，對(duì)其進(jìn)行定向性狀改造，具有十分重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種農(nóng)桿菌介導(dǎo)對(duì)麻風(fēng)樹進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的方法，解決現(xiàn)有育種技術(shù)無(wú)法遺傳改良的問(wèn)題。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案農(nóng)桿菌介導(dǎo)對(duì)麻風(fēng)樹進(jìn)行基因轉(zhuǎn)化的方法，包括以下步驟：

(1)制備麻風(fēng)樹外植體以及農(nóng)桿菌液，外植體經(jīng)農(nóng)桿菌浸染后進(jìn)行共培養(yǎng)；

(2)共培養(yǎng)后的外植體接入篩選培養(yǎng)基C13PC進(jìn)行培養(yǎng)，從而獲得抗性愈傷組織，所述篩選培養(yǎng)基C13PC是含有1-3mg/L草胺磷或1-10mg/L潮霉素；

(3)分化出不定芽；以及

(4)生根培養(yǎng)，從而獲得轉(zhuǎn)基因植株。

所述第(1)步驟中，共培養(yǎng)優(yōu)選采用C13A培養(yǎng)基含有50-200μM乙酰丁酰酮。

所述第(1)步驟中，共培養(yǎng)采用優(yōu)選采用C13A固體培養(yǎng)基，其含有1.0-3.0mg/L?6-芐基嘌呤，0.25-1.0mg/L?3-吲哚丁酸，以及50-200μM乙酰丁酰酮的MS培養(yǎng)基；麻風(fēng)樹外植體的制備經(jīng)由以下工藝：挑選麻風(fēng)樹種子經(jīng)消毒后，取出完整的胚和子葉，于MS培養(yǎng)基培養(yǎng)，獲得子葉，切制成外植體；農(nóng)桿菌菌液是優(yōu)選采用C13A液體培養(yǎng)基重懸浮離心收集的農(nóng)桿菌體制得。

所述第(1)步驟中，獲得麻風(fēng)樹外植體工藝中，接種于MS培養(yǎng)基萌發(fā)，是將接好的材料先暗培養(yǎng)2-4天，然后光照培養(yǎng)10-12天，種子萌發(fā)的培養(yǎng)條件是，溫度23-26℃，光照12-16小時(shí)/天，光照強(qiáng)度1800-2000lx。

所述第(1)步驟中，農(nóng)桿菌菌液的準(zhǔn)備、浸染及共培養(yǎng)，進(jìn)一步包括以下工藝步驟：

(a)挑取農(nóng)桿菌的單克隆于含有抗生素的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃，200rpm震蕩培養(yǎng)20-24小時(shí)，然后按照1∶100轉(zhuǎn)接，震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，OD600＝0.8-1.0，將菌液轉(zhuǎn)入50ml離心管，常溫，4000rpm離心20分鐘收集菌體，用C13A液體培養(yǎng)基重新懸浮農(nóng)桿菌，調(diào)至OD600＝0.3-0.6，28℃震蕩培養(yǎng)1-2個(gè)小時(shí)，備用；

(b)將切好的葉片放入容器中，加入準(zhǔn)備好的菌液，置于搖床慢速震蕩5-15分鐘；以及

(c)取出浸染過(guò)的材料，倒掉菌液，將葉片放在濾紙上，吸去多余的菌液，接入C13A固體培養(yǎng)基，置于23-26℃黑暗共培養(yǎng)2-4天。

所述第(2)步驟的篩選培養(yǎng)基C13PC是優(yōu)選采用含有1.0-3.0mg/L?6-芐基嘌呤，0.25-1.0mg/L?3-吲哚丁酸，1-3mg/L草胺磷或1-10mg/L潮霉素，250-500mg/L頭孢噻肟鈉的MS培養(yǎng)基。

所述第(2)步驟進(jìn)一步包括以下工藝步驟：