[發明專利]一種堿性磷酸酶結合物的合成工藝

無效

• 申請號: 201010192646.6
• 申請日: 2010-06-04
• 公開（公告）號: CN102269761A
• 公開（公告）日: 2011-12-07
• 發明（設計）人: 錢純亙;李可;張裕平
• 申請（專利權）人: 深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 付磊;林毅斌

發明領域

本發明涉及酶結合物的制備方法，更具體地說，涉及一種新的堿性磷酸酶標記物的合成方法。

發明背景

堿性磷酸酶是一種廣泛存在于動物、植物、微生物等中的酶。經常使用的堿性磷酸酶從小牛腸粘膜和大腸桿菌中提煉，由多個同功酶組成。在適宜的緩沖液中，堿性磷酸酶可以催化水解硝基苯磷酸鹽(PNP)、β-甘油磷酸鈉、磷酸萘酯、3-(2-螺旋金剛烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1，2-二氧環乙烷(AMPPD)等含磷酸根基團的顯色底物和化學發光底物。鑒于此，堿性磷酸酶作為一種標記酶，廣泛應用于臨床免疫診斷中。

堿性磷酸酶的結合物是通過化學合成的方法將堿性磷酸酶和待結合物結合在一起，也稱酶標記物。免疫診斷中常用的酶結合物包括酶結合抗原、酶結合抗體和酶結合葡萄球菌蛋白A等。酶結合物質量的好壞直接關系到免疫酶技術的成功與否，因此被稱為關鍵的試劑。酶結合物主要應用于免疫印跡雜交(Western?blotting)、酶聯免疫吸附測定(enzyme?linked?immunosorbent?assay，ELISA)、化學發光酶免疫分析(chemiluminescence?enzyme?immunoassay，CLEIA)及免疫組化等免疫檢測和定量分析。

目前本領域中常用的酶結合物的合成方法主要有三種：

1.戊二醛交聯法。戊二醛是一種雙功能團試劑，它可以使酶與待結合物的氨基通過它而聯結。堿性磷酸酶結合物一般用此法進行合成。合成方法分一步法、兩步法兩種。在一步法中戊二醛直接加入酶與待結合物的混合物中，反應后即得酶結合物。在兩步法中，先將酶與戊二醛作用，透析除去多余的戊二醛后，再與待結合物作用而形成酶結合物。也可先將待結合物與戊二醛作用，再與酶聯結。但是，這種方法合成的堿性磷酸酶結合物的活性和結合率都不夠理想，影響免疫分析的靈敏度。

2.過碘酸鹽氧化法。本方法只適用于含糖量較高的酶。辣根過氧化物酶的標記常用此法。反應時，過碘酸鈉將辣根過氧化物酶分子表面的多糖氧化為很活潑的醛基，可與蛋白質上的氨基形成Schiff氏堿而結合。這種方法的操作較為復雜，合成后酶和待結合物活性損失較多，也不適合堿性磷酸酶結合物的合成。

3.琥珀酰亞胺-馬來酰亞胺交聯法。同時帶有可與氨基反應的琥珀酰亞胺酯類和可與巰基反應的馬來酰亞胺基團的異源雙功能交聯試劑常用于制備酶結合物。這種交聯試劑常用的有4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸琥珀酰亞胺酯(SMCC)或其水溶性類似物4-(N-馬來酰亞胺基甲基)環己烷-1-羧酸-3-磺基琥珀酰亞胺酯(sulfo-SMCC)，它們可通過活化酶分子的氨基得到帶有馬來酰亞胺基團的酶分子，酶分子上的馬來酰亞胺基團可以和巰基化結合物上的巰基基團反應，最后得到酶結合物。該方法所用試劑昂貴，而且，待結合物通常會因為需經過巰基化處理，操作復雜。

因此，有必要開發一種新的方法，合成具有更高結合率和活性的堿性磷酸酶結合物。

發明概述

在第一個方面，本發明涉及一種合成堿性磷酸酶結合物的方法。僅僅是為了說明的目的，本發明方法可稱為碳二亞胺法。本發明的方法包括以下步驟：步驟a)，用碳二亞胺和任選的羥基琥珀酰亞胺活化堿性磷酸酶分子的羧基，生成活性堿性磷酸酶酯；步驟b)，任選調節體系pH至堿性，加入待結合物，使得堿性磷酸酶酯與待結合物的合成反應，生成堿性磷酸酶結合物。

在第二個方面，本發明涉及使用本發明方法獲得的堿性磷酸酶結合物。

在第三個方面，本發明涉及用于堿性磷酸酶標記的試劑盒，其包括碳二亞胺，以及任選的pH調節劑。優選地，該試劑盒還包括指示操作者按照本發明方法進行操作的說明、離心超濾管或兩者。

附圖說明

圖1圖示了本發明方法的一個實施方案。

圖2是泌乳素濃度-發光值的線性擬合，其中使用本發明方法對已知濃度的泌乳素抗體進行標記，獲得堿性磷酸酶-泌乳素抗體結合物，并測定其發光值。以泌乳素抗體濃度為X軸，以發光值為Y軸，以最小二乘法進行濃度-發光值的線性擬合。

具體實施方式