[發明專利]植物營養成分含量的快速提取檢測法

有效

• 申請號: 201010191832.8
• 申請日: 2010-06-01
• 公開（公告）號: CN101865888A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 王紹東;馮曉;王曉云;李文濱;喜多村啟介;朱秀清;李遠明;富校軼;劉偉;姜妍;王浩;劉燕;李宏偉;張平;姚磊
• 申請（專利權）人: 黑龍江省大豆技術開發研究中心
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/36
• 代理公司: 北京科龍寰宇知識產權代理有限責任公司 11139
• 代理人: 孫皓晨;費碧華

技術領域

本發明涉及一種植物營養成分、尤其是大豆的功能性營養成分含量的快速提取檢測方法，特別涉及一種能同步快速地提取大豆多基因聚合育種雜交后代的功能性營養成分，并借助HPLC所具有的檢測功能，對其進行定性、定量的方法，由此可快速對其雜交后代進行篩選。

背景技術

許多植物種子，尤其大豆種子不僅富含優質的植物性蛋白質和脂肪酸，而且也含有異黃酮、維生素E等多種功能性營養成分。尤其是近年來，隨著生活水平的提高，消費者對大豆異黃酮、維生素E等功能性營養成分的需求急劇上漲。但是，在現有的已育成推廣的大豆品種中，尚沒有綜合農藝性狀好，異黃酮、維生素E等功能性營養成分含量均高的品種，極大地影響了大豆本身的加工利用價值，降低了深加工企業的經濟效益。

利用大豆基因聚合雜交育種手段，將控制異黃酮、維生素E、葉黃素等功能性營養成分含量的基因，聚合到同一個基因組中，從而培育出異黃酮、維生素E及葉黃素含量都高的大豆新品種，提高大豆綜合利用價值。現有的維生素E(Tocopherol)提取分析技術有多種，過去常用Emmerie-Engel法(EE法)、熒光法、薄層層析法(TLC法)等。近年來，隨著高效液相色譜(HPLC)技術的不斷改良，利用液相色譜分析技術基本可以對維生素E的四個同分異構體α-Tocopherol(α-生育酚)、β-Tocopherol(β-生育酚)、γ-Tocopherol(γ-生育酚)和δ-Tocopherol(δ-生育酚)進行簡單的定性定量分析(DellaPenna，2005，Ujiieet?al.，2005)。同樣做為類胡蘿卜素一種的葉黃素(Lutein：一種強抗氧化物質，白內障、老年型黃斑變性癥的預防)(Monma?et?al.，1994，Kanamaru?et?al.，2006)，以及女性荷爾蒙樣物質的異黃酮(Isoflavone)提取分析技術，近年來常用高效液相色譜法(HPLC)進行定性及定量分析(王春娥等，1998，Wang?1994)。

這些現有的維生素E、葉黃素以及異黃酮分析技術，在受檢樣品數、質量不受限的前提下，均可對大豆種子進行種子維生素E、葉黃素以及異黃酮進行定性定量分析。但是，傳統方法需要樣品的數量或質量多，提取步驟繁瑣，費時費力費試劑，對環境污染大。問題是在基因聚合后的雜交后代每粒種子的功能性營養成分含量檢測選拔方面，由于這些現有的異黃酮、維生素E和葉黃素的分析檢測技術，都是各自獨立的分析系統，1次取樣只能支持上述1種營養成分的選拔。要想知道每一粒珍貴的雜交后代種子的上述兩種或三種成分的含量，必須分兩次或三次分別取樣(每次≥20mg)，分別進行HPLC的定性定量分析。而雜種后代每粒種子的質量較小，而且一粒種子具有的性狀都各不相同，若利用現有技術對其多次取樣分析后，即便從中選出符合育種目標的雜交后代種子，由于種子被多次取樣切除，將剩余部分種子播種后，終因不能正常出苗而無法完成下個世代增殖繁育，進而無法實現預期的育種目標。

以維生素E和葉黃素雜交聚合育種后代為例，因具有高維生素E(母本14-16g/100粒)和高葉黃素(6-8g/100粒)含量的親本百粒重均較小，雜交前期世代的單粒種子質量，只有60-100mg左右，經過兩次取樣分析篩選后，即便獲得維生素E和葉黃素含量雙高的后代，也會因種子自身被過多的切除而失去后代繁育能力，進而無法實現預期的育種目標(Wang?et?al.，2007)。

而且，檢測未成熟大豆子葉中維生素E等的含量時，因種子中很多成分正處于形成期或處于欲檢測成分的前驅體狀態，用傳統的方法檢測時，會檢出很多的未知的相互粘連的峰，根本無法定性目標峰，更無法準確定量目標成分的含量。限制了未成熟大豆子葉中很多酶基因的表達解析，及關聯基因標記的開發。

因此，在大豆(植物)多基因聚合雜交育種后代選拔過程中，迫切需要一種只進行“一次取樣，多種功能性營養成分可同步提取、檢測的技術”。該問題一旦解決，不僅為大豆品質改良育種工作者解決了“育種瓶頸”，也為谷物、食品檢測等領域，提供了便利的檢測方法，降低了檢測成本，減少了人財物的浪費及環境污染。

發明內容

為了解決大豆功能性營養成分基因聚合育種雜交后代個體選拔過程中，存在的在同一世代的同一粒種子，含有的多種目標成分，無法同時進行定量檢測分析的難題，本發明的目的在于提供一種提取檢測方法，以實現“一次取樣，多種功能性營養成分可同步提取、檢測”，進而加快育種后代選拔進程，培育高附加值大豆新品種；同時也為了縮短檢測時間，降低人力、物力、財力的投入，減少檢測廢棄物的對環境的污染。