[發(fā)明專利]一種鯊魚血管生成抑制因子及其生產(chǎn)純化方法和應(yīng)用

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010191511.8
• 申請日: 2010-05-28
• 公開（公告）號(hào): CN101891811A
• 公開（公告）日: 2010-11-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 謝秋玲;梁旭方;陳小佳;洪岸
• 申請（專利權(quán)）人: 暨南大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K14/475
• 分類號(hào): C07K14/475;C07K1/22;C12N15/12;C12N15/63;C12N1/21;A61K38/18;A61P35/00;C12R1/19
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 陳衛(wèi)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種鯊魚血管生成抑制因子及其生成純化方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

鯊魚是極少患惡性腫瘤的海洋動(dòng)物之一，其發(fā)病率為百萬分之一。美國科學(xué)家Luer將高劑量的強(qiáng)致癌劑黃曲霉素B1注射到鯊魚體內(nèi)，也不能誘發(fā)鯊魚患癌癥。給鯊魚接種癌細(xì)胞也不能誘發(fā)癌癥。這提示鯊魚體內(nèi)具有獨(dú)特的抗腫瘤機(jī)制(賀麗虹1，黃建華2，沈頌東等，海洋科學(xué)/2005年/第29卷/第11期：63-66)。

多年來，世界各國的研究人員多數(shù)是對鯊魚軟骨組織進(jìn)行了研究，從中分離提取了多種具有腫瘤抑制作用，尤其是抑制腫瘤新生血管生長的多種物質(zhì)，如Lee等(Lee?A，Langer?R.Shark?cartilage?contains?inhibitors?of?tumorangiogenesis)首次從一條姥鯊的鰭和脊椎軟骨中分離提取了一種強(qiáng)烈抑制實(shí)體瘤新生血管生成的活性蛋白質(zhì)。

這類從鯊魚軟骨中提取的具有血管生成抑制活性的蛋白質(zhì)稱之為鯊魚血管生成抑制因子(Shark?Cartilage?Angiogenesis?Inhibiting?Factor，SCAIF)。Sheu等(Sheu?JR，F(xiàn)uCC，Tsai?ML，et?al.Effect?of?U-995，a?patent?shark?cartilage-derived?angiogenesis?inhibitor，on?anti-angiogenesis?and?antitumor?activities[J].Anticancer?Res，1998，18(6A)：4435)。從藍(lán)鯊軟骨中分離純化了由兩條多肽組成的新血管生成抑制因子U-995，可顯著抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖與遷移，并會(huì)引起新血管的中斷和破裂，阻止破壞由腫瘤壞死因子TNF-α誘導(dǎo)的雞胚絨毛尿囊膜血管生成，防止由膠原酶誘導(dǎo)的膠原溶解。

目前，從各種鯊魚軟骨中分離提取的物質(zhì)純度不等，相對分子量大小不一，理化性質(zhì)和生物學(xué)活性不盡相同的蛋白質(zhì)和多糖類物質(zhì)。更有人直接將鯊魚軟骨粉作為口服藥物，如1997年，加拿大批準(zhǔn)鯊魚軟骨口服液AE2941/Neovastat進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)，它是至今進(jìn)入III期臨床試驗(yàn)為數(shù)不多的抗血管生成藥物之一。

目前鯊魚血管抑制因子(SAIF)的相關(guān)專利主要集中在提取的鯊魚血管生成抑制因子和鯊魚軟骨粗制劑的制備和應(yīng)用。由于鯊魚的天然資源日漸枯竭，而鯊魚人工養(yǎng)殖技術(shù)難題至今未能突破，造成了SAIF無法大規(guī)模應(yīng)用于臨床的困境，因此通過基因工程的手段克隆獲得血管生成抑制因子無疑成為大規(guī)模生產(chǎn)SAIF的唯一途徑，這對于我國海洋藥物產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展與海洋生物資源保護(hù)也將產(chǎn)生積極的影響。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于根據(jù)現(xiàn)有鯊魚血管抑制因子的研究中存在的來源少、無法大規(guī)模應(yīng)用于臨床的問題，通過基因工程的手段得到一種鯊魚血管生成抑制因子的氨基酸序列。

本發(fā)明另一目的在于提供鯊魚血管生成抑制因子的cDNA序列。

本發(fā)明另一目的在于提供一種包含鯊魚血管生成抑制因子的cDNA序列的重組表達(dá)載體。

本發(fā)明另一目的在于提供一種表達(dá)鯊魚血管生成抑制因子的重組微生物。

本發(fā)明另一目的在于提供上述鯊魚血管生成抑制因子的生產(chǎn)純化方法。

本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供上述鯊魚血管生成抑制因子的應(yīng)用。

本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

本發(fā)明通過PCR克隆技術(shù)從條紋斑竹鯊軟骨中獲得鯊魚血管生成抑制因子(SCAIF)的全長cDNA序列，該序列長692bp，序列如SEQ?ID?NO：2所示，其中包括552bp的開放閱讀框(從第15個(gè)堿基～第563個(gè)堿基，包括一個(gè)終止密碼子)，編碼183個(gè)氨基酸，氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示。

本發(fā)明將上述鯊魚血管生成抑制因子的基因序列與表達(dá)載體相連接，構(gòu)建包含鯊魚血管生產(chǎn)抑制因子cDNA的重組表達(dá)載體，然后轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，最終獲得能夠表達(dá)鯊魚血管生成抑制因子的重組蛋白。

本發(fā)明鯊魚血管生成抑制因子的生產(chǎn)方法具體包括如下步驟：

(1)從鯊魚軟骨組織中提取總RNA；

(2)根據(jù)現(xiàn)有已知的鯊魚血管生成抑制因子序列的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，序列如SEQ?ID?NO：4～9所示；

(3)通過PCR擴(kuò)增得到鯊魚血管生成抑制因子的基因全長序列；

(4)將所得基因序列克隆至表達(dá)載體中，得到重組表達(dá)載體；