[發明專利]抗櫛孔扇貝顆粒血細胞的單克隆抗體及其制備方法

有效

• 申請號: 201010191436.5
• 申請日: 2010-06-03
• 公開（公告）號: CN101863979A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 邢婧;戰文斌;繩秀珍;林聽聽
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C07K16/18
• 分類號: C07K16/18;C12N5/20;C12R1/91
• 代理公司: 青島海昊知識產權事務所有限公司 37201
• 代理人: 王鐸

技術領域

本發明涉及一種由雜交瘤細胞分泌的抗櫛孔扇貝(Chlamys?farreri)顆粒血細胞的單克隆抗體及其制備方法，屬于貝類細胞免疫學技術領域。

背景技術

貝類缺乏免疫球蛋白和特異性免疫，其免疫防御過程是由血細胞和血淋巴中的體液因子協同完成。血細胞通過自溶、聚集、吞噬、包囊、胞吐、氧化殺傷等方式，達到識別、包裹和清除外來異物的目的；血細胞還能通過釋放溶菌素、凝集素、調理素等物質來調理輔助體液因子免疫，其在貝類抵御外界環境刺激及外來病原微生物侵襲的過程中起著關鍵作用。

目前貝類血細胞的分類大多根據形態及其染色親和性，胞質中細胞器的多寡、顆粒的有無而將其分為兩大類：透明血細胞和顆粒血細胞。透明血細胞細胞質染色很淡，幾乎不含顆粒或含微量顆粒，極少或完全沒有細胞器。顆粒血細胞細胞質中含有數量不等的染色顆粒，顆粒為由單層或雙層膜包裹的球形小體，其內部含有豐富的活性物質，如髓過氧化物酶、酸性磷酸酶、吞噬素、溶菌酶、葡糖苷酸酶等。大量研究表明無論是透明血細胞還是顆粒血細胞其在抵御病原入侵和機體免疫修復過程中發揮著重要作用。有些研究認為當貝類受寄生蟲入侵時，顆粒血細胞會大量聚集，通過脫顆粒的方式釋放活性物質等來改變和調理寄生蟲表面分子結構，并形成包繞寄生蟲的內芽瘤或包囊；而透明血細胞則在造血作用中較為重要，造血組織腫瘤狀物的增生就來源于透明血細胞。但是，這兩類血細胞在功能和發生等問題中的作用和地位，一直沒有確切的定論，主要是因為沒有合適的分子標記物跟蹤其發生和參加免疫反應的過程。單克隆抗體因其特異性強、靈敏度高、無交叉性等特點被成功應用于醫學、高等動物免疫細胞的定位、發生、分化研究中。最近，應用該技術來研究牡蠣血細胞的形態、結構特性，對蝦血細胞的分類、免疫特性和貽貝免疫力的報道不斷出現。因此制得抗櫛孔扇貝顆粒血細胞的單克隆抗體，有助于研究顆粒血細胞在扇貝胚胎發育中的發生、分化和分布，以及顆粒血細胞與其它類型血細胞免疫功能上的轉換和差異。

發明內容

本發明的一個目的是提供一種由雜交瘤細胞分泌的抗櫛孔扇貝顆粒血細胞的單克隆抗體；本發明的另一個目的是提供所述抗櫛孔扇貝顆粒血細胞的單克隆抗體的制備方法。

本發明的任務是由以下技術方案實現的：研制了一種抗櫛孔扇貝顆粒血細胞的單克隆抗體，所述的單克隆抗體是由名稱為：雜交瘤細胞株6H7，保藏號為：CCTCC?NO：C201042，保藏單位為：中國典型培養物保藏中心，保藏日期為：2010年04月21日的雜交瘤細胞分泌的。長勢良好的該雜交瘤細胞常規培養2-3天，其培養基由桃紅色轉變為黃色，該培養基中即含有大量由該雜交瘤細胞分泌的抗櫛孔扇貝顆粒血細胞的單克隆抗體。該單克隆抗體能與櫛孔扇貝顆粒血細胞特異性結合，并與其他組織細胞無交叉反應。

一種抗櫛孔扇貝顆粒血細胞單克隆抗體的制備方法，其步驟如下：抽取櫛孔扇貝血淋巴經離心得到全血細胞；經介質密度梯度分離法得到櫛孔扇貝顆粒血細胞；以顆粒血細胞為抗原免疫BALB/c小鼠；融合被免疫小鼠的脾細胞和骨髓瘤細胞；經間接免疫熒光法篩選、克隆、進一步篩選得到一株能分泌抗櫛孔扇貝顆粒血細胞單克隆抗體的雜交瘤細胞6H7；其分泌的抗體即為抗顆粒血細胞的單克隆抗體，經流式免疫熒光法驗證其特性。

所述的介質密度梯度分離法是Percoll介質梯度離心法：將櫛孔扇貝全血細胞懸液置于不連續Percoll梯度的頂層，離心分離所得的自上而下的第三層細胞即為顆粒血細胞。

所述的間接免疫熒光法是將細胞融合后所得的雜交瘤細胞培養上清液與櫛孔扇貝全血細胞懸液或血滴片反應；繼而加入異硫氰熒光素(FITC)標記的羊抗鼠抗體；用熒光顯微鏡在原位的暗視野與明視野下鏡檢，篩選抗顆粒血細胞的單克隆抗體，即單克隆抗體6H7。

所述的流式免疫熒光法是將單克隆抗體6H7與櫛孔扇貝全血細胞懸液于培養板孔中反應；繼而加入異硫氰熒光素(FITC)標記的羊抗鼠抗體；用流式細胞儀檢測驗證單克隆抗體6H7所抗的細胞群確為顆粒血細胞群。

本發明的優點在于：由雜交瘤細胞6H7分泌的抗櫛孔扇貝顆粒血細胞的單克隆抗體能與櫛孔扇貝顆粒血細胞特異性結合。長勢良好的該雜交瘤細胞具有大小均一，外觀飽滿，渾圓透亮，分裂旺盛，能無限分泌單一、純凈抗體的特點。該雜交瘤細胞在培養基中常規培養2-3天，培養基中即含有了大量靈敏度高，效價好，特異性抗櫛孔扇貝顆粒血細胞，且與其他組織細胞無交叉性的單克隆抗體。抗櫛孔扇貝顆粒血細胞單克隆抗體的制得為研究顆粒血細胞在扇貝胚胎發育中的發生、分化和分布，以及顆粒血細胞與其它類型血細胞免疫功能上的轉換和差異提供重要的技術手段。