[發明專利]利用新疆紫草毛狀根生產紫草素的方法

無效

• 申請號: 201010191022.2
• 申請日: 2010-06-03
• 公開（公告）號: CN101869591A
• 公開（公告）日: 2010-10-27
• 發明（設計）人: 王芳;麻浩;陳永芳;蘆葦華
• 申請（專利權）人: 新疆農業大學
• 主分類號: A61K36/30
• 分類號: A61K36/30;A61K8/97;A01H4/00;A23L1/275;C09B61/00;C07C46/10;A61P15/00;A61P29/00;A61P35/00;A61P31/04;A61P31/12;A61P1/16;A61P37/02
• 代理公司: 烏魯木齊中科新興專利事務所 65106
• 代理人: 張莉

技術領域

本發明屬于植物生物技術領域，涉及一種利用新疆紫草毛狀根生產紫草素的方法。

背景技術

新疆紫草Arnebia?euchroma(Royle)Johnst是多年生藥用植物，紫草的主要成分為紫草素，是萘醌類化合物，是紫草中臨床藥效最好的一種，其有效成分為紫草素及其衍生物，具有顯著的抗生育、抗炎、抗腫瘤、殺菌抗病毒、保肝和免疫調節等藥理作用，同時作為色素可用于化妝品、食品及印染，在醫藥、食品、化妝品、印染領域有著巨大的市場潛力。新疆紫草占全國資源量的80％以上，是國內外商品紫草的主要來源。但新疆紫草依賴種子繁殖，生長3-5年才開花、結果，且種子成熟度和發芽率較低，自然修復緩慢，加之近年來大規模的無序采挖，產量也直線下降，年采挖量不足20噸，使新疆紫草野生資源處于瀕危的邊緣，對新疆的生態環境已造成極大破壞，為此，我國早在1996年就已將新疆紫草列為國家二級保護植物。為拓寬新疆紫草的開發利用途徑，國內外學者進行了硬紫草的田間栽培、新疆紫草及硬紫草的細胞和組織培養、紫草素人工合成等許多研究。目前新疆紫草大面積人工栽培尚未見報道，且由于此法占用耕地、生長緩慢，藥材產量低，有效成分低，受生態環境影響，同時藥用植物的大田栽培往往使用大量的農藥，造成嚴重的農藥殘留和重金屬殘留問題，不能滿足市場需求而受到限制。日本早在20世紀80年代中期已實現了紫草細胞培養生產紫草素。但是，利用細胞培養生產紫草素還存在一些問題，如細胞培養生長緩慢，細胞容易聚集，細胞遺傳與生理易變異，細胞代謝途徑和代謝產物形成與細胞生長關系復雜，隨生產規模的擴大紫草素產量不穩定或呈降低趨勢，生產時間過長和生產成本過高等問題，限制了其工業化的發展。因此，尋找一種新的生產紫草素及其衍生物的方法以解決市場的需求勢在必行。毛狀根是發根農桿菌(Agrobacterium?rhizogenes)Ri質粒誘發的結果，具有生長迅速，分支多，在無激素培養基上能夠自主、持續生長，次生代謝產物含量高且穩定的特性，為藥用植物次生代謝產物(如藥物、天然色素、香料、天然調味品等)的工業化生產提供了一條有效途徑。目前轉化成功的植物已有200多種，人參、黃連等已能通過毛狀根培養法進行工業化生產。新疆紫草毛狀根國內未見報道。利用新疆紫草毛狀根誘導和培養，以代替天然新疆紫草，生產有效成分紫草素，對保護其野生資源和生態環境，促進新疆紫草的產品開發和產業化具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于，提供一種利用新疆紫草毛狀根生產紫草素的方法，該方法包括新疆紫草外植體的選擇和處理、發根農桿菌的活化培養、子葉外植體的感染和毛狀根的誘導、無菌新疆紫草毛狀根根系的獲得及新疆紫草毛狀根的液體培養及紫草素的提取等步驟，是利用生長階段快速繁殖的毛狀根為試材，采用M-9液體培養基作為生產紫草素的培養基，從而利用培養的毛狀根達到產業化生產紫草素的目的。由于誘導出的毛狀根具有在培養基上快速自主生長的特性，因而它能克服利用細胞培養時細胞培養物生長緩慢、需外加激素維持其生長的不足，而且具有培養時操作簡便、紫草素產量穩定、成本低、不受氣候、土地等自然條件的限制等優點。尤其為利用毛狀根培養法生產紫草素提供了一種穩定、可持續的新型藥源，為今后應用生物反應器進行紫草素規?；a提供了可靠的材料來源和物質基礎，對保護新疆紫草野生資源及其進一步開發利用具有重要意義。

本發明所述的一種利用新疆紫草毛狀根生產紫草素的方法，下列步驟進行：

新疆紫草毛狀根的誘導：

a、將新疆紫草種子用75％酒精消毒30s-60s，再用0.1％升汞表面消毒5-10min，無菌水充分漂洗后過夜，再用抗生素頭孢噻肟鈉浸泡60min，接種在1/2MS固體培養基上，溫度25℃±1℃，黑暗環境培養15-20d，得到無菌苗，切取無菌苗幼嫩子葉，接種在1/2MS固體培養基上，溫度25℃±1℃，黑暗環境中1/2MS固體培養基預培養2d，待用；

b、將發根農桿菌按常規方法接于YEB固體培養基上，黑暗培養2d后，挑取單菌落接種于YEB液體培養基中，溫度28℃，轉速160-180r/min，振蕩培養過夜，所得菌液置于溫度4℃，轉速5000r/min的離心機中離心5-10min，所得菌體再用MS液體培養基重懸后用于感染；

c、將子葉外植體置于步驟b的發根農桿菌菌液中，浸泡5-15min，取出，于1/2MS固體培養基中共培養2d后，轉接在含頭孢噻肟鈉的1/2MS固體培養基上，溫度25℃±1℃，黑暗培養形成毛狀根；