[發(fā)明專利]利用新疆紫草毛狀根生產(chǎn)紫草素的方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010191022.2
• 申請(qǐng)日: 2010-06-03
• 公開（公告）號(hào): CN101869591A
• 公開（公告）日: 2010-10-27
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王芳;麻浩;陳永芳;蘆葦華
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A61K36/30
• 分類號(hào): A61K36/30;A61K8/97;A01H4/00;A23L1/275;C09B61/00;C07C46/10;A61P15/00;A61P29/00;A61P35/00;A61P31/04;A61P31/12;A61P1/16;A61P37/02
• 代理公司: 烏魯木齊中科新興專利事務(wù)所 65106
• 代理人: 張莉

1.一種利用新疆紫草毛狀根生產(chǎn)紫草素的方法，其特征在于按下列步驟進(jìn)行：

新疆紫草毛狀根的誘導(dǎo)：

a、將新疆紫草種子用75％酒精消毒30s-60s，再用0.1％升汞表面消毒5-10min，無(wú)菌水充分漂洗后過(guò)夜，再用抗生素頭孢噻肟鈉浸泡60min，接種在1/2MS固體培養(yǎng)基上，溫度25℃±1℃，黑暗環(huán)境培養(yǎng)15-20d，得到無(wú)菌苗，切取無(wú)菌苗幼嫩子葉，接種在1/2MS固體培養(yǎng)基上，溫度25℃±1℃，黑暗環(huán)境中1/2MS固體培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)2d，待用；

b、將發(fā)根農(nóng)桿菌按常規(guī)方法接于YEB固體培養(yǎng)基上，黑暗培養(yǎng)2d后，挑取單菌落接種于YEB液體培養(yǎng)基中，溫度28℃，轉(zhuǎn)速160-180r/min，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，所得菌液置于溫度4℃，轉(zhuǎn)速5000r/min的離心機(jī)中離心5-10min，所得菌體再用MS液體培養(yǎng)基重懸后用于感染；

c、將子葉外植體置于步驟b的發(fā)根農(nóng)桿菌菌液中，浸泡5-15min，取出，于1/2MS固體培養(yǎng)基中共培養(yǎng)2d后，轉(zhuǎn)接在含頭孢噻肟鈉的1/2MS固體培養(yǎng)基上，溫度25℃±1℃，黑暗培養(yǎng)形成毛狀根；

d、將步驟c的毛狀根剪取2-3cm，轉(zhuǎn)入含頭孢噻肟鈉的1/2MS固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行單根離體培養(yǎng)，每7d繼代一次，逐漸降低抗生素濃度，直至無(wú)菌為止，再采用PCR、rolC基因序列分析和Southern分子雜交對(duì)毛狀根進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化鑒定，確定毛狀根株系；

新疆紫草毛狀根的生長(zhǎng)

e、將步驟d毛狀根接種于無(wú)銨的MS或SH或1/2MS液體培養(yǎng)基中，加入0.5-1g/L酸水解酪蛋白，肌醇1g/L，15-30g/L的蔗糖，pH值5.6-6.0，溫度25±1℃，轉(zhuǎn)速為100-120r/min的條件下進(jìn)行振蕩、黑暗培養(yǎng)12-15d；

新疆紫草毛狀根生產(chǎn)紫草素

f、將步驟e生長(zhǎng)的毛狀根接種于含酸水解酪蛋白0.5-1g/L和蔗糖15-30g/L的M-9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)5-15d，添加大孔吸附樹脂NKA-9?1g/瓶，pH值為5.6-6.0，溫度25±1℃，轉(zhuǎn)速100-120rpm的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，25-30d為一個(gè)培養(yǎng)周期，取出毛狀根，溫度50℃烘干，研磨成粉，用濃度95％乙醇浸提3次，合并提取液，濃縮，即可得到紫草膏。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a中子葉切塊是在無(wú)菌條件下，將子葉切成0.2-0.5cm²的小塊或?qū)⒆尤~周圍切除。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟a、步驟c和步驟d中所用抗生素頭孢噻肟鈉的濃度為500-1000mg/L。