[發(fā)明專(zhuān)利]一種納米纖維固定化β-D-半乳糖苷酶的制備方法

無(wú)效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201010190222.6
• 申請(qǐng)日: 2010-05-25
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN101864408A
• 公開(kāi)（公告）日: 2010-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 蘇志國(guó);張羽飛;張松平;鄭國(guó)建
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)科學(xué)院過(guò)程工程研究所
• 主分類(lèi)號(hào): C12N11/08
• 分類(lèi)號(hào): C12N11/08;D01D5/00
• 代理公司: 暫無(wú)信息
• 代理人: 暫無(wú)信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種納米纖維固定化β-D-半乳糖苷酶的制備方法，屬于酶的固定化及其應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

β-D-半乳糖苷酶(β-D-galactosidase，β-gal，EC?3.2.1.23)具有催化β-半乳糖苷鍵水解和生成的雙重功能，在乳品、保健品和洗滌劑生產(chǎn)等領(lǐng)域均有重要用途。利用β-gal的水解作用將牛奶中的乳糖分解為半乳糖和葡萄糖，能獲得可供乳糖不耐癥人群飲用的乳品；將β-gal的水解功能與葡萄糖異構(gòu)酶的異構(gòu)化作用相結(jié)合可將乳糖溶液轉(zhuǎn)化為半乳糖果糖糖漿，從而替代蔗糖用于食品加工。另一方面，利用β-gal的轉(zhuǎn)半乳糖苷功能可合成低聚半乳糖、低聚乳果糖等多種功能性低聚糖，這些低聚糖可促進(jìn)體內(nèi)雙歧桿菌的增殖和礦物元素的吸收，保健功效尤為突出；在兩相體系中β-gal還可催化半乳糖和低碳脂肪醇合成烷基半乳糖苷的反應(yīng)，作為新型非離子表面活性劑烷基半乳糖苷在化妝品和洗滌劑工業(yè)中用途廣泛。

目前的實(shí)際生產(chǎn)中，無(wú)論是水解乳糖的反應(yīng)還是轉(zhuǎn)糖苷反應(yīng)多在游離β-gal的催化下進(jìn)行，游離酶難以自反應(yīng)液中回收，不僅增加反應(yīng)成本，而且使得產(chǎn)物分離步驟更加繁瑣。通過(guò)β-gal的固定化有望解決上述問(wèn)題，同時(shí)酶穩(wěn)定性也將得到提高。

國(guó)內(nèi)外研究人員就β-gal的固定化已開(kāi)展大量工作。日本專(zhuān)利JP8256769以silica顆粒為載體，采用先吸附再用戊二醛交聯(lián)的方式固定化β-gal，有效提高酶的活力和穩(wěn)定性。CN1587404以粒徑為200-600μm的黃原膠、瓜爾豆膠等多糖微球?yàn)檩d體，也通過(guò)戊二醛交聯(lián)固定化β-gal，酶活力回收率達(dá)62％。以上酶固定化方式雖有助于提高酶穩(wěn)定性，但粒徑為納米或微米尺度的固定化酶仍無(wú)法以便捷方式回收利用。CN101191782先將β-gal交聯(lián)在醛基化環(huán)糊精微球表面，再將載酶微球分別涂抹至兩張聚碳酸酯微孔膜上，向膜上滴加海藻酸鈉溶液，再將兩張膜共同浸泡于氯化鈣溶液中固化，即得三明治結(jié)構(gòu)的β-gal酶膜，固定化酶膜半衰期15-20天，穩(wěn)定性良好，且塊狀膜易于回收，但此法的缺點(diǎn)是存在嚴(yán)重的擴(kuò)散限制。

由靜電紡絲法制備的納米纖維是新興的酶固定化載體，自2002年被首次用于酶固定化后納米纖維由于比表面積大而能大量負(fù)載酶分子，由于孔隙率高僅有極小擴(kuò)散阻力，由于宏觀上以無(wú)紡布形式存在而易于回收利用等諸多優(yōu)勢(shì)便被廣泛認(rèn)可。在已有的文獻(xiàn)報(bào)道中，α-胰凝乳蛋白酶和脂肪酶等均曾被高效固定化在高分子納米纖維上。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種高效固定化β-gal的新方法，以靜電紡絲法制備的苯乙烯-馬來(lái)酸酐共聚物(PSMA)納米纖維為載體固定化β-gal，所制得的固定化酶易于回收重復(fù)利用，具有高負(fù)載量、高活力和高穩(wěn)定性。

本發(fā)明的技術(shù)方案：一種納米纖維固定化β-gal的制備方法，是以PSMA納米纖維為載體，利用載體上的酸酐基團(tuán)直接固定化β-gal，所述固定化酶的步驟為：

(1)靜電紡絲制備PSMA納米纖維：將一定量的PSMA溶解于有機(jī)溶劑中，在室溫磁力攪拌的條件下充分溶解制得濃度為20～40％(W/V)的電紡液。將電紡液吸入注射器內(nèi)進(jìn)行靜電紡絲，控制注射器針頭至接收板的距離為10～30cm，電紡液流速為250～1000μL/h，電壓在15～50kV之間調(diào)節(jié)，制得PSMA納米纖維，室溫放置直至溶劑完全揮發(fā)。

(2)PSMA納米纖維的預(yù)處理：取步驟(1)制備的PSMA納米纖維在25％(V/V)的乙醇水溶液中浸泡15min以增加其親水性，再分別用水和緩沖溶液沖洗兩次。

(3)β-gal的固定化：用pH值介于2.5～8.0的緩沖溶液配制0.1～5.0mg/mL的β-gal溶液。經(jīng)步驟(2)處理后的PSMA納米纖維浸入β-gal溶液中，在4～25℃條件下于搖床震蕩固定化0.5～15h。取出固定化酶用緩沖溶液充分洗去纖維表面未固定化的酶，最后浸泡在0.2mol/L的醋酸-醋酸鈉緩沖液中(pH4.5)，于4℃保存。

本發(fā)明的有益效果：目前未見(jiàn)有利用納米纖維作為載體固定化β-gal的報(bào)道。利用PSMA納米纖維固定化β-gal，固定化條件溫和，所得固定化酶活力維持率高，酶負(fù)載量高且易于回收重復(fù)利用。該固定化酶可應(yīng)用于乳糖水解、烷基半乳糖苷合成和酶?jìng)鞲衅鞯榷鄠€(gè)領(lǐng)域。

附圖說(shuō)明

圖1為實(shí)施例二制備PSMA納米纖維的掃描電鏡照片

圖2為實(shí)施例三制備固定化β-gal的重復(fù)使用穩(wěn)定性

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一