[發(fā)明專利]奶牛乳腺腺泡泌乳模型的體外構(gòu)建方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010187301.1
• 申請日: 2010-05-31
• 公開（公告）號: CN101857852A
• 公開（公告）日: 2010-10-13
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 李慶章;林葉;侯曉明;高學(xué)軍
• 申請（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 金永煥

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及泌乳模型的體外構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

乳腺是乳汁合成和分泌的場所。以前在體外研究乳腺的泌乳功能與調(diào)控，多是采用在二維平臺上培養(yǎng)的乳腺上皮細胞作為研究載體。但研究表明，乳腺上皮細胞一但被分離出來放到二維（平面）條件去培養(yǎng)，很快就會失去組織特異性功能。在乳腺上皮細胞二維培養(yǎng)的時候，催乳素雖然可以激活STAT5（信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5），但是這種STAT5的激活是瞬時的，不能誘導(dǎo)乳蛋白基因的表達。而乳腺腺泡作為最小的泌乳功能單位則不同，腺泡結(jié)構(gòu)不但可以使催乳素受體在腺泡上皮細胞基底側(cè)表達，而且可持續(xù)激活STAT5。這種利用組成性激活STAT5的結(jié)構(gòu)表明腺泡狀結(jié)構(gòu)對乳腺細胞內(nèi)染色體重組和β-酪蛋白轉(zhuǎn)錄是必需的。因此，體外培養(yǎng)的乳腺腺泡將逐漸取代乳腺上皮細胞，成為體外研究乳腺泌乳功能調(diào)控的新平臺。

對乳腺腺泡模型的研究國際上最早是以小鼠為研究對象。1994年，Hurley等將妊娠中期的小鼠乳腺上皮細胞在含有EHS（Engelbreth-Holm-Swarm）基質(zhì)的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，乳腺細胞團形成帶有空腔的腺泡樣結(jié)構(gòu)，細胞之間連接緊密。形成腺泡結(jié)構(gòu)的乳腺上皮細胞具有分泌極性，可以向腺泡腔中分泌酪蛋白和乳鐵傳遞蛋白。1995年，Blatchford等將³⁵S標(biāo)記的亮氨酸添加到培養(yǎng)基中，應(yīng)用體外培養(yǎng)的小鼠乳腺腺泡模型研究乳蛋白的分泌方式發(fā)現(xiàn)，乳腺上皮細胞存在頂漿分泌和基底側(cè)分泌兩種方式。1998年，Blatchford等又用小鼠乳腺腺泡模型研究泌乳反饋抑制因子（feedbackinhibitoroflactation,FIL）的特性，發(fā)現(xiàn)在這個模型中FIL不能抑制乳蛋白分泌，這是因為腺泡模型中緊密的胞間連接阻止了FIL與腺泡腔側(cè)乳腺腺泡上皮細胞表面FIL受體的相互作用。1999年，Blatchford等證實EHS基質(zhì)上乳腺腺泡模型的形成是由于位于細胞團中心的細胞選擇性凋亡所致。在腺泡形成的過程中，與乳腺細胞凋亡相關(guān)的胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白5（IGFBP5）表達升高。以小鼠乳腺腺泡模型為基礎(chǔ)，2004年，Dontu等在體外成功構(gòu)建了人類乳腺腺泡模型并以此研究Notch信號促進乳腺細胞增殖的作用。2006年，Liu等也用培養(yǎng)的人類乳腺腺泡模型研究Hedgehog信號促進乳腺細胞自我更新的作用。同年Sharp等體外培養(yǎng)了海熊的乳腺腺泡模型。

目前，國內(nèi)外均沒有利用妊娠期奶牛乳腺上皮細胞構(gòu)建腺泡模型的報道，而在畜牧業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究中，奶牛作為最主要的產(chǎn)奶經(jīng)濟動物，奶牛的產(chǎn)奶量和泌乳機能研究是相當(dāng)重要的研究領(lǐng)域，利用已知的小鼠、人等物種的乳腺腺泡來研究奶牛的泌乳功能是不可行的；其原因是物種間的種屬差異造成基因組結(jié)構(gòu)、生理機能的不同；另外小鼠和人類乳腺腺泡體外構(gòu)建采用了較厚的基質(zhì)成份，且所用的細胞為轉(zhuǎn)染了逆轉(zhuǎn)錄病毒的細胞；這種轉(zhuǎn)染后的細胞改變了細胞自身的生長特性，雖然也可以在體外發(fā)育成乳腺腺泡模型結(jié)構(gòu)，但是由于構(gòu)成腺泡模型的細胞自身已經(jīng)不同于機體內(nèi)真實的狀態(tài)，因此此模型結(jié)構(gòu)也就失去了乳腺泌乳的真實性，如單純的采用此種方法構(gòu)建奶牛乳腺腺泡泌乳模型也必然存在模擬體內(nèi)環(huán)境真實性降低的問題。

以往在體外研究奶牛乳腺的泌乳功能時均以乳腺上皮細胞為研究載體，但是乳腺上皮細胞一旦從乳腺組織中分離出來，進行常規(guī)的細胞培養(yǎng)，隨著傳代次數(shù)的增加，其組織特異性功能逐漸消失，大大降低了細胞實驗?zāi)M體內(nèi)環(huán)境的真實性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的是為了解決現(xiàn)有體外研究奶牛乳腺的泌乳功能時均以乳腺上皮細胞為研究載體，存在模擬體內(nèi)環(huán)境真實性低的問題，而提供奶牛乳腺腺泡泌乳模型的體外構(gòu)建方法。