[發明專利]一種乙烯基修飾的基因芯片、其制備方法及應用

有效

• 申請號: 201010186945.9
• 申請日: 2010-05-21
• 公開（公告）號: CN101831503A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 劉迎春;高源
• 申請（專利權）人: 北京歐凱納斯科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王朋飛;王加嶺

技術領域

本發明涉及一種基因芯片，具體地說，涉及一種乙烯基修飾的基因芯片、其制備方法及應用。

背景技術

基因芯片(Gene?Chip)通常指DNA芯片，其基本原理是指將大量寡核苷酸分子固定于支持物上，然后與標記的樣品進行雜交，通過檢測雜交信號的強弱進而判斷樣品中靶分子的數量?；蛐酒母拍瞵F已泛化到生物芯片(biochip)、微陣列(Microarray)、DNA芯片(DNAchip)，甚至蛋白芯片。基因芯片集成了探針固相原位合成技術、照相平板印刷技術、高分子合成技術、精密控制技術和激光共聚焦顯微技術，使得合成、固定高密度的數以萬計的探針分子以及對雜交信號進行實時、靈敏、準確的檢測分析變得切實可行。基因芯片技術在分子生物學研究領域、醫學臨床檢驗領域、生物制藥領域和環境醫學領域顯示出了強大的生命力，其中關鍵技術在于基因芯片具有微型化、集約化和標準化的特點，從而有望實現“將整個實驗室縮微到一片芯片上”的愿望。基因芯片在國內外已形成研究與開發的熱潮，許多科學家和企業家將基因芯片同當年的PCR技術相提并論，認為核酸雜交技術的集成化已經和正在使分子生物學領域發生一場變革，將帶來巨大的社會效益和經濟效益。

寡核苷酸在基片表面的固定是制作基因芯片的第一步，因此制備高質量的基因芯片基片，實現寡核苷酸的有效固定是基因芯片研究的關鍵技術之一?；d體的材料表面必須有可以進行化學反應的活性官能團，以便與生物分子進行偶聯；而載體本身應當是惰性的，即有足夠的穩定性和良好的生物兼容性。理想的基因芯片基片應具有以下特點：1)基片的熒光背景信號低；2)固定的寡核苷酸必須穩定，在雜交、洗滌和分析過程中不易脫落；3)有足夠的固定密度以保證檢測分析時能產生足夠強的檢測信號；4)適度的固定容量；5)盡量減少非特異性吸附。目前適用于制作基片載體的材料有玻璃片、硅片、金基底、尼龍、纖維素和聚丙烯酰胺等。基片表面的活性官能團修飾主要有氨基、醛基、環氧基等，但是環氧基修飾基片過程較為復雜，固定效率不高；氨基修飾基片雖較為簡單，但結合固定效果不理想；醛基修飾基片的固定量較低，靈敏度不高，穩定性方面也存在問題。

發明內容

本發明旨在克服現有技術的不足，提供一種穩定的、結合強度大、固定效率高、熒光背景低的乙烯基修飾的基因芯片。

本發明的另一目的是提供上述乙烯基修飾的基因芯片的制備方法。

本發明的進一步目的是提供用上述乙烯基修飾的基因芯片在固定寡核苷酸中的應用。

為了實現本發明目的，本發明的一種乙烯基修飾的基因芯片，其基因芯片的基片載體表面上帶有末端含碳碳雙鍵的活性官能團，其結構如式1所示，

式1

其中，n為1-10的整數，m為大于1的整數。

前述的基因芯片，其中制備所述基片載體的材料包括無機材料或有機高分子材料，所述無機材料包括玻璃、硅片、金屬(例如金、銀、鐵、鋅、銅)等；有機高分子材料包括殼聚糖、葡聚糖、聚乙烯醇、纖維素、聚丙烯酰胺、聚碳酸酯、聚苯乙烯、聚乳酸或聚丙烯酸酯等。

制備本發明乙烯基修飾的基因芯片的方法，其包括步驟：

1)用乙醇將基片載體洗凈；

2)采用分子自組裝技術將10-15mM的三乙氧基硅基烯組裝在羥基化或氨基化的基片載體表面，形成一層末端為雙鍵的單分子自組裝膜，在無水乙醇中漂洗兩遍，氮氣吹干；

3)將上述所得基片載體放置在烘箱中，50-120℃下烘烤30-60min，即得。

本發明提供的乙烯基修飾的基因芯片在固定寡核苷酸中的應用，其具體方法為：

1)將1當量5’-端帶有末端雙鍵修飾的寡核苷酸和0.5％-1％當量Grubbs催化劑溶于DMSO中，配制成寡核苷酸濃度為1mM的點樣液；

2)用點樣儀吸取上述點樣液，在基片上設定的矩陣上點樣，點樣量是5-20nL，點樣后的基片放置在37℃相對濕度為75％的恒溫恒濕箱中避光固定8-12小時；

3)清洗，甩干。

所述的5’-端帶有末端雙鍵修飾的寡核苷酸，其3’-端還帶有熒光基團，其結構如式2所示，

式2

其中，n為1-10的整數，F代表熒光基團。

本發明的優點和有益效果是：

(1)本發明提供的乙烯基修飾的基因芯片，其基片修飾方法簡單、方便，適合大規模生產，基片載體來源豐富。

(2)本發明采用分子自組裝技術，將活性基團通過共價鍵固定在基片載體表面，不易脫落，固定率高，而且可以保證表面活性基團的高密度性和均一性。