[發(fā)明專利]一種超聲波介導(dǎo)的微生物遺傳轉(zhuǎn)化方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010186403.1
• 申請日: 2010-05-31
• 公開（公告）號: CN101875947A
• 公開（公告）日: 2010-11-03
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宋厚輝;林璐;黃巍;徐健
• 申請（專利權(quán)）人: 中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所
• 主分類號: C12N15/87
• 分類號: C12N15/87;C12N13/00;C12R1/01;C12R1/145
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責(zé)任公司 11021
• 代理人: 周長興

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物遺傳轉(zhuǎn)化領(lǐng)域，具體涉及一種采用低頻超聲波介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法將DNA、RNA、多糖、蛋白等生物大分子轉(zhuǎn)化入細胞中。

本發(fā)明還涉及一種采用低頻超聲波介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法在難轉(zhuǎn)化微生物(革蘭氏陽性細菌)以及微生物遺傳代謝工程中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

嗜熱、厭氧、革蘭氏陽性菌的轉(zhuǎn)化一直是令科學(xué)家頭疼的問題，在國際上成功的報道一直很少。原因是：嗜熱細菌由于適應(yīng)其特殊的生存環(huán)境，與常溫細菌不同，其細胞膜厚且通透性低，而且外來核酸必須通過特定的DNA結(jié)合蛋白才能實現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運。對于革蘭氏陽性菌，由于其細胞壁上特殊的多層肽聚糖結(jié)構(gòu)也難以轉(zhuǎn)化，而且當雙鏈DNA結(jié)合到細胞膜上之后，馬上會被膜上的核酸酶降解，失去完整性。對于嚴格厭氧細菌來說，進行遺傳轉(zhuǎn)化時整個操作過程必須在厭氧工作站中進行，操作步驟非常繁瑣。因此對于嗜熱厭氧且為革蘭氏陽性細菌的轉(zhuǎn)化更是難上加難，目前成功的報道僅限于采用基于高壓電擊的電轉(zhuǎn)化儀和電擊杯，通過高壓電穿孔的方法完成(Tyurin?et?al.，2004，Tyurin?et?al.，2005)，而且這一方法在國內(nèi)外僅有美國達特茅斯學(xué)院Lee?Lynd所在的實驗室可以成功，其它實驗室無法重復(fù)。

而嗜熱厭氧革蘭氏陽性菌又被廣泛應(yīng)用于以木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)綠色低碳的可再生生物燃料。目前我們面臨的最大問題是這些嗜熱厭氧革蘭氏陽性菌降解纖維素的能力和糖醇轉(zhuǎn)化率普遍較低，無法進一步實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化。因此對這些嗜熱厭氧革蘭氏陽性菌必須進行基因工程改造。而進行這一遺傳改造的前提是必須建立一種簡單、快速的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

目前報道的在微生物中可以進行遺傳操作的轉(zhuǎn)化體系主要有結(jié)合轉(zhuǎn)移(Conjugation)和電穿孔轉(zhuǎn)化(Electroporation)。其中結(jié)合轉(zhuǎn)移需要供體菌的參與才能介導(dǎo)DNA植入受體菌中。而對于嗜熱厭氧革蘭氏陽性菌，目前還沒有發(fā)現(xiàn)合適的供體菌。因此，目前對嗜熱厭氧革蘭氏陽性菌的轉(zhuǎn)化完全依賴電轉(zhuǎn)(Klapatch?et?al.，1996，Mai?et?al.，1997，Tyurin?et?al.，2004)，而這一方法如果采用常規(guī)商業(yè)化的電轉(zhuǎn)化儀，轉(zhuǎn)化效率不會超過10²/μgDNA。

低頻超聲波介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法是近幾年才發(fā)現(xiàn)的、一種處于不斷完善的新方法。該方法的原理是通過超聲波在細胞膜表面瞬時產(chǎn)生微型囊泡，該囊泡在形成的同時可以裹入與之相鄰的核酸、多糖等生物大分子。然后囊泡破裂并在細胞膜上形成一個納米通道，其包裹的生物大分子通過納米通道和細胞膜在自我修復(fù)的同時嵌入細胞內(nèi)部，完成“攝入”或者轉(zhuǎn)化過程。該方法最初主要用于真核細胞的轉(zhuǎn)化和基因療法(Liu?et?al.，2006，Manomeet?al.，2005，Newman?&?Bettinger，2007)。在原核生物中的報道始于2007年(University?of?Sheffield)(Song?et?al.，2007)。但是目前報道的超聲波轉(zhuǎn)化法仍然僅僅局限在革蘭氏陰性菌或者中溫菌中。主要包括大腸桿菌(Escherichia?coli?DH5a)、具核梭桿菌(Fusobacterium?nucleatum)、熒光假單胞菌(Pseudomonas?fluorescens)和惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)。對于該方法若經(jīng)改進，能否應(yīng)用于革蘭氏陽性菌、高溫菌或者古菌，目前未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種低頻超聲波介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化微生物的方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用基于超聲波聲致穿孔的原理，通過超聲波在微生物細胞膜表面形成的瞬時囊泡，將細胞外部的生物大分子(脫氧核糖核酸、核糖核酸、蛋白、多糖等)裹入其中，然后通過細胞膜的自我修復(fù)功能，使膜上的囊泡連同內(nèi)容物一起攝入細胞內(nèi)部。由于超聲波功率過大時，也可以在細胞內(nèi)部形成空泡，該空泡破裂時釋放的能量足以使整個細胞破碎。為了避免這一弊端，本發(fā)明采用的超聲波為低頻(0.1-1000千赫)、低功率(0.01-1000瓦特)。這一設(shè)置可以保證在細胞膜上形成囊泡的同時，不破壞細胞膜和周圍生物大分子的結(jié)構(gòu)。由于本發(fā)明中超聲波介導(dǎo)的方法采用非探頭式接觸，所有反應(yīng)過程培養(yǎng)液原位進行，因此更安全可靠。該方法可以應(yīng)用于難轉(zhuǎn)化微生物(如：高溫、厭氧的革蘭氏陽性細菌)核酸物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，還可以應(yīng)用于控制生物反應(yīng)器中特定底物(核酸、多糖、蛋白以及特定化學(xué)藥物等生物大分子)與細胞的接觸、攝取和代謝過程。既可以對單個細胞、單個反應(yīng)器操作，也可以實現(xiàn)高通量，而且操作簡單，隨意控制，并可以實現(xiàn)遠程遙控。