[發(fā)明專利]靶向性白細胞介素融合蛋白及其制備方法與應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010185503.2
• 申請日: 2010-05-28
• 公開（公告）號: CN102260352A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發(fā)明（設計）人: 周兵;姜靜;周宇;鄧磊修;劉武
• 申請（專利權）人: 山東先聲麥得津生物制藥有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;C12N5/10;C12N1/19;C12N1/21;A01K67/00;A61K38/20;A61K47/48;A61P35/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 馮瓊;李玉秋

技術領域

本發(fā)明涉及生物領域，具體涉及白細胞介素融合蛋白及其制備和其在醫(yī)藥領域的應用。

背景技術

傳統(tǒng)治療癌癥的方法有手術治療、化學治療、放射治療和激素治療等。近年來，開發(fā)選擇性作用于特定靶點的高效、低毒、特異性強的抗腫瘤分子靶向藥物已成為重要研究開發(fā)方向。腫瘤免疫治療已成為最活躍的抗腫瘤靶向研究領域之一，單克隆抗體、細胞過繼免疫治療、腫瘤疫苗、細胞因子治療已顯示出與傳統(tǒng)療法的互補性。

白細胞介素2(IL-2)是本領域熟知的一種白細胞介素，發(fā)現(xiàn)于1976年，Morgan等人用植物的血球凝集素刺激正常的人淋巴細胞，發(fā)現(xiàn)其可以產生一種能選擇性促進T淋巴細胞生長的細胞因子，它必須和IL-2受體結合才能發(fā)揮生物學效應。IL-2是多種生物功能細胞因子，可刺激細胞毒T淋巴細胞分化、激活細胞毒T淋巴細胞、自然殺傷細胞、嗜酸性細胞、肥大細胞的非特異性殺傷功能，也能增強B淋巴細胞的抗體分泌和增殖。因此臨床上也主要用于免疫佐劑調動機體的系統(tǒng)免疫，達到輔助治療控制腫瘤的目的。

作為第一個被分離純化的白細胞介素分子，80年代美國Cetus公司開發(fā)人源重組IL-2用于治療癌癥，直至1993年，IL-2被FDA批準用于治療腎癌和黑色素瘤；目前IL-2也被批準大劑量用于治療HIV。臨床試驗表明IL-2單藥治療癌癥的有效率低，副作用大。高劑量治療黑色素瘤的客觀有效率為5-27％，其中只有0-4％的病人病情完全緩解。IL-2的副作用大，病人產生體液儲留、腹瀉、血壓過低等一系列反應，小部分患者死亡，這些毒副作用多與IL-2引發(fā)非治療病灶的全身其他組織免疫過度反應有關。

針對于IL-2臨床使用的局限，目前IL-2蛋白質藥物研究主要方向是減小藥物副作用、提高藥效、延長藥物半衰期。策略主要包括IL-2的聚乙二醇(PEG)修飾、與人血清白蛋白(HSA)融合延長半衰期，糖基化修飾提高IL-2穩(wěn)定性，與單克隆抗體融合將藥物靶向到特定靶點(如腫瘤細胞)，與其他蛋白(如免疫調節(jié)因子)融合產生藥物聯(lián)用效果等。在臨床實驗中，PEG修飾的IL-2與IL-2相比，并沒有顯著改善半衰期和有效率，至今未被FDA批準用于癌癥治療。Human?GenomeSciences公司開發(fā)了HSA-IL-2融合蛋白Albuleukin，靜脈注射Albuleukin的血漿半衰期從IL-2的19分鐘提高到6小時，目前已進入二期臨床實驗。天然IL-2的第三位Thr是被糖基修飾的，目前IL-2的糖基化地手段分為真核細胞表達、以及合成的糖基化短肽和IL-2蛋白連接兩種策略，Symansis公司用人293細胞表達hcxIL-2已經(jīng)在市面上出售，國內有若干個實驗室都開發(fā)酵母表達糖基化的IL-2，目前還處于開發(fā)階段。目前默克公司將抗神經(jīng)節(jié)苷脂GD2的C端融合IL-2的抗體藥物EMD273066(hu14.18-IL-2)用于治療黑色素瘤已經(jīng)完成I期臨床，結果表明33例病人中，8例病情穩(wěn)定。無4級毒性反應(死亡)發(fā)生，但仍發(fā)現(xiàn)有低血壓、組織缺氧等3級毒性反應。此外也有將IL-2融于其他抗體(如anti-her2antibody，anti-her3，IgG3等)的研究，以增強IL-2誘導的T細胞對腫瘤細胞殺傷特異性。其他IL-2融合蛋白藥物，如Aerolysin-IL-2，IL-6-IL-2，GCSF-IL-2、重組人α胸腺素原-白介素2等，產生藥物聯(lián)用的效果。

對于與生物大分子耦聯(lián)/融合的白介素-2可能存在的問題是，雖然半衰期延長但藥物分子量的成倍增加使其更難于穿過生理屏障到達靶組織，尤其對大型實體瘤的浸潤性差，使其難于穿過生理屏障到達腫瘤部位。靶向藥物的特異性和親和性不高會造成靶向藥物在到達靶組織以前損傷正常細胞，消耗了藥效。

針對上述問題，首先要選擇特異性高的腫瘤抗原為靶點，另外還要通過蛋白質工程對靶向藥物進行合理設計，減小分子質量，提高親和力和特異性，增加藥物在腫瘤組織的濃度和減少在正常組織的分布，減少對正常細胞的毒副作用。可以選擇主要靶向于腫瘤新生血管內皮細胞和腫瘤細胞的靶向短肽及非抗體蛋白，其中有針對腫瘤新生血管內皮細胞表面分子氨基肽酶N的NGR和整聯(lián)蛋白(integrins?αvβ3)的RGD。某些利用上述的相關靶向肽的開發(fā)藥物，已經(jīng)成功進入臨床實驗。如Modmed公司開發(fā)ARENEGYR就為NGR融合腫瘤壞死因子(NGR-hTNFα)，用于治療直腸癌、肝癌、間皮瘤已經(jīng)進入II期臨床。GE公司開發(fā)用于腫瘤診斷的藥物18F-AH111585(放射性標記的RGD)也進入一期臨床。