[發明專利]一種麝香抗炎活性的檢測方法

無效

• 申請號: 201010185346.5
• 申請日: 2010-05-28
• 公開（公告）號: CN101865914A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 肖小河;金城;羅云;趙艷玲;周健;溫瑞卿
• 申請（專利權）人: 中國人民解放軍第三〇二醫院
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;A61K35/55;A61P29/00
• 代理公司: 北京東正專利代理事務所(普通合伙) 11312
• 代理人: 劉瑜冬

技術領域

本發明屬于中藥活性參數檢測技術領域，具體是涉及一種麝香抗炎活性檢測方法的技術。

背景技術

麝香作為中藥具有開竅醒神、消腫止痛、活血調經的功效，臨床上廣泛用于治療瘡瘍腫毒，咽喉腫痛、跌打損傷等癥，抗炎作用被認為是麝香的主要藥理活性之一。

現有技術在檢驗中藥抗炎活性時，通常采用的藥理實驗方法是整體動物實驗法，該方法首先通過一些炎癥介質致使動物某些部位發生炎癥，然后對該炎癥部位使用不同抗炎藥物進行對比實現，根據炎癥部位的重量、體積等變化判斷藥物的抗炎活性強度，如小鼠耳腫脹、大鼠足腫脹實驗法等。一般來說，上述整體動物實驗法難以給出精確地量化評價，操作步驟復雜，費用高，干擾因素多，作為麝香的生物效價檢測方法具有一定局限性。

已有藥物分析中發現，環氧酶(COX)是花生四烯酸(AA)代謝過程中重要的限速酶之一，COX有兩中結構型，即COX-1和COX-2，通過抑制COX可以減輕炎癥反應、從而實現抑制炎癥的發展。因此，COX途徑是抗炎藥物發揮作用的重要途徑之一，然而由于COX-1選擇性不強，藥物對其抑制往往產生許多副作用；相比之下，特異性地抑制COX-2的功能逐漸成為研究開發抗炎藥物的目標。

發明內容

本發明的目的是為了解決已有整體動物實驗法檢測中藥抗炎活性時，檢測結果不能定量，成本高，操作步驟復雜的缺陷，利用抗炎中藥對COX-2活性抑制強度可以表征待測品抗炎活性原理，提供了一種測定麝香抗炎活性的方法。

實現上述目的本發明的技術方案為，一種麝香抗炎活性的檢測方法，該方法包括以下步驟：

(1)取麝香提取、提取液配制成不同濃度的溶液為待測品A；

(2)配制系列濃度的前列腺素(PG)標準品溶液B；

(3)配制系列濃度的的阿司匹林溶液作為陽性對照品C；

(4)分別配制背景組，環氧酶II(COX-2)100％初始活性組，陽性對照組及麝香供試品組4種反應體系組；

(5)進行環氧酶II(COX-2)反應步驟：即取上述步驟(4)所制得的四組反應液，混勻，37℃水浴孵育10～20min；孵育后的四組反應液中均加入10μl花生四烯酸，混勻，37℃水浴孵育2min；

(6)取步驟(5)中經COX-2反應的四組反應液，加入1M?HCl?50μl，停止水浴，每組均加入100μl飽和SnCl2溶液，混勻，室溫放置5min；

(7)將步驟(6)所得的四組反應液分別稀釋；

(8)將步驟(7)獲得的一系列前列腺素供試品，采用試劑盒，通過酶免疫法，測定各組反應液吸收度值，并以PG標準品溶液B得到的吸收度標準曲線計算各組反應液中前列腺素的含量，供試品D、E、F、G的前列腺素含量分別為C_D，C_E，C_F，C_G；

(9)根據供試品D、E、F、G的前列腺素含量分別計算陽性對照組抑制率和麝香供試品組抑制率；

(10)根據(9)步得到的陽性對照組抑制率和麝香供試品組抑制率，采用“二劑量”法對麝香供試品組抑制率進行可靠性檢驗，從而確定麝香抗炎活性效價。

步驟(1)中的溶劑通常采用強極性溶劑，可以選自水、甲醇、乙醇中的一種或兩種以上的混合物，不同濃度待測品A的方法是以20-100倍麝香樣品量的強極性溶劑進行分步提取10-60分鐘，濾過，收集濾液；或以20-100倍麝香樣品量的強極性溶劑靜置提取30分鐘后超聲10分鐘。

步驟(1)、(2)、(3)中的待測品A濃度為大于0％小于100％，前列腺素(PG)標準品溶液B對數濃度為3.3、3、2.7、2.4、2.1、1.8、1.5、1.2及陽性對照品C的濃度為大于0％小于80％。

步驟(4)中4種反應體系組的配置方法為：

背景組：反應緩沖液+經高溫滅活的COX-2+抗氧劑，體積比為97∶1∶1；

COX-2100％初始活性組：反應緩沖液+COX-2+抗氧劑，體積比為97∶1∶1；

陽性對照組：反應緩沖液+COX-2+抗氧劑+陽性對照C，體積比為95∶1∶1∶2；

麝香供試品組：反應緩沖液+COX-2+抗氧劑+待測品A，體積比為95∶1∶1∶2；

其中，反應緩沖液的配制為：Tris-HCl+EDTA+苯酚，并調節pH至8.0，質量比為1.6∶0.15∶0.02。