[發明專利]用原核表達系統制備銅綠假單胞菌外膜蛋白OprF的方法

無效

• 申請號: 201010184859.4
• 申請日: 2010-05-27
• 公開（公告）號: CN101831440A
• 公開（公告）日: 2010-09-15
• 發明（設計）人: 胡成進;王燕
• 申請（專利權）人: 胡成進
• 主分類號: C12N15/31
• 分類號: C12N15/31;C12N15/70;C07K14/21
• 代理公司: 濟南泉城專利商標事務所 37218
• 代理人: 張貴賓

(一)技術領域

本發明屬于醫學研究領域，特別涉及一種用原核表達系統制備銅綠假單胞菌外膜蛋白OprF的方法。

(二)背景技術

銅綠假單胞菌是一種條件致病菌，其導致的感染占革蘭陰性感染的10％，常繼發于腫瘤、大面積創傷、燒傷及使用免疫抑制劑等機體免疫力低下患者，感染類型多樣，可侵害呼吸道、消化道、泌尿系統、骨髓和皮膚等。

關于銅綠假單胞菌的檢測，目前實驗室多用傳統的細菌培養方法。隨著免疫學方法的快速發展，如何用抗原抗體的特異性反應快速有效的檢測銅綠假單胞菌感染，已被研究人員廣泛關注。

銅綠假單胞菌含有兩種主要的抗原性細胞外膜成分：脂多糖類和外膜蛋白。OprF及其抗體可以作為免疫預防和快速檢測的工具，是因為它具有以下優點：1.暴露于菌體表面，具有較高的免疫原性；2.在遺傳上具有較高的保守性，其疫苗可與17種不同的血清型銅綠假單胞菌具有較好的交叉免疫性。

在20多種銅綠假單胞菌外膜蛋白中，OprF是免疫原性較強的一種。已有研究證明，OprF羧基端暴露于菌體表面，抗原決定簇較多，免疫原性更強。

(三)發明內容

本發明為了彌補現有技術的不足，提供了一種特異性高、檢測速度快的用原核表達系統制備銅綠假單胞菌外膜蛋白OprF的方法。

本發明是通過如下技術方案實現的：

一種用原核表達系統制備銅綠假單胞菌外膜蛋白OprF的方法，主要包括如下步驟：

(1)從銅綠假單胞菌中提取基因組DNA，通過PRC(聚合酶鏈式反應)擴增OprF羧基端，并將其克隆至原核表達載體pET28b中，構建重組表達載體pET28b-OprF；

(2)重組質粒經酶切和序列測定后，轉化E.coli?BL21，IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導表達，進行SDS-PAGE(聚丙烯酰氨凝膠電泳)檢測；

(3)經Ni-NTA親和層析柱純化后得到元和表達的OprF蛋白。

所述擴增OprF羧基端采用的引物為上游引物5’-TCGAAGCTTGCTCCGGCTCCGGAAC?CGGTTGCCG?AC-3’(HindIII)和下游引物5’-ACCTCGAGTTCAA?CGCGACGGTT?GA?AGCGCG-3’(XholI)。

本發明利用原核表達系統構建并表達OprF蛋白，為今后采用雜交瘤技術獲得OprF特異性單克隆抗體或免疫動物獲得多價特異性抗血清，通過膠體金免疫層析技術達到對銅綠假單胞菌的快速篩查檢測奠定研究基礎。

(四)附圖說明

下面結合附圖對本發明作進一步的說明。

圖1為本發明pET28b-OprF載體的示意圖；

圖2為pET28b-OprF載體中OprF的測序結果。

(五)具體實施方式

實施例：

用細菌基因組提取試劑盒提取銅綠假單胞菌基因組DNA，以此為目的基因PCR擴增模板，根據GenBank公布的銅綠假單胞菌OprF基因核苷酸序列(NC_002516)，設計引物：上游引物5’-TCGAAGCTTGCTCCGGCTCCGGAAC?CGGTTGCCG?AC-3’(HindIII)和下游引物5’-ACCTCGAGTTCAA?CGCGACGGTT?GA?AGCGCG-3’(XholI)。擴增的目的基因OprF片段大小為470bp左右，編碼約140個氨基酸的肽段(190-342aa?OprF)。OprF片段與克隆載體pMD19simple-T連接過夜，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，以含有氨芐/X-Gal/IPTG的LB瓊脂平板篩選，用藍白斑法篩選陽性克隆。

將驗證正確的含pMD19simple-T-OprF重組質粒的菌株中提取質粒DNA，并進行HindIII和XholI雙酶切，1.5％瓊脂糖凝膠電泳回收目的片段，與用相同處理的pET28b質粒連接過夜，轉化DH5α感受態細胞，涂布含25μg/mL卡那霉素的LB平板，用PCR和酶切鑒定陽性克隆子，將陽性克隆擴增提取質粒后轉化BL21感受態細胞。

測序正確的陽性克隆轉化E.coli?BL21，1mMIPTG在37℃條件下誘導表達OprF蛋白，用SDS-PAGE電泳和western-blot進行驗證。