[發明專利]一種浮游植物群落結構的檢測方法

無效

• 申請號: 201010184785.4
• 申請日: 2010-05-28
• 公開（公告）號: CN101838700A
• 公開（公告）日: 2010-09-22
• 發明（設計）人: 米鐵柱;孫靜;甄毓;于志剛
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;G01N27/447
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 吳蔭芳

1.一種浮游植物群落結構的檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

a、浮游植物水樣采集

b、DNA的提取

c、PCR及瓊脂糖電泳檢測

d、使用變性梯度凝膠電泳技術進行浮游植物群落結構分析

e、圖形處理

f、數據分析。

2.根據權利要求1所述浮游植物群落結構的檢測方法，其特征在于，所述步驟a為：浮游植物水樣首先用200目的篩絹過濾，然后將過濾后的海水用0.45μm孔徑的硝酸纖維素膜過濾，將濾膜轉移至2ml?Eppendorf管中，置于-20℃，用于浮游植物群落多樣性的分析。

3.根據權利要求1所述浮游植物群落結構的檢測方法，其特征在于，所述步驟b為：

(1)收集和洗滌藻細胞：在收集的藻細胞中中加入750μl?TE緩沖液洗滌藻細胞，10000rpm?4℃離心10分鐘，小心棄上清；加入250μl?TE緩沖液懸浮藻細胞；

(2)裂解藻細胞：加入500μl預熱55℃的抽提緩沖液，混和均勻，放入55℃水浴中一小時，直到藻液呈透明狀；放進4℃冰箱冷卻3分鐘；

(3)抽提：加入1ml氯仿∶異戊醇(24∶1)，輕柔顛倒，使之呈乳濁液；14000rpm?4℃離心10分鐘，小心用微量吸頭取出上清液(約600μl)至eppendorf管中，重復抽提一次；

(4)沉淀：加二倍體積的冰冷的無水乙醇和1/10體積的NaAc，混勻，放入-80℃冰箱30分鐘；14000rpm?4℃離心10分鐘，小心棄上清；

(5)洗滌：DNA沉淀用預冷的70％酒精洗兩次；

(6)溶解：自然風干，溶于20-40μl?TE緩沖液中，置于-20℃待用。

4.根據權利要求1所述浮游植物群落結構的檢測方法，其特征在于，所述步驟c中PCR進行擴增所使用的引物為：

FP-5’CGCGCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCAGGTCTGTGATGCCC3’，RP-5’ACGGGCGGTGTGTRC3’，

所述PCR擴增所用引物或者為：

F1427-5’CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGG3’，

R1616-5’GCGGTGTGTACAAAGGGCAGGG3’，

所述PCR反應體系(50ul)包括：

模板DNA，

200μM?dNTP，

1.5mM?MgCl2，

0.3μM引物，

2.5U?Ex?Taq?DNA?polymerase，

1×Ex?Taq?Buffer；

所述PCR的反應程序為：

94℃，變性2min；

72℃，延伸7min；

PCR反應程序或者為：

94℃，變性5min；

72℃延伸10min。

5.根據權利要求4所述浮游植物群落結構的檢測方法，其特征在于，所述步驟c中瓊脂糖電泳檢測為：將5μl擴增的產物與1ul上樣緩沖液混合后上樣，1％瓊脂糖凝膠電泳，100V恒壓電泳30min，在含0.5μg/ml?EB的1×TAE緩沖液中染色10～30min，用凝膠成像系統進行拍照。

6.根據權利要求1所述浮游植物群落結構的檢測方法，其特征在于，所述步驟d為：采用Bio-Rad公司DcodeTM的基因突變檢測系統對PCR反應產物進行變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析，所述電泳條件為：PCR產物分析采用8％的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度從35％到50％(100％的變性劑為7M的尿素和40％的去離子甲酰胺的混合物)，150V，1×TAE緩沖液中電泳6h；或者，PCR產物分析采用10％的聚丙烯酰胺凝膠，變性劑濃度從30％到55％，150V，1×TAE緩沖液中電泳8h；電泳完畢后，將凝膠置于0.5μg/ml?EB溶液中震蕩染色20min，凝膠成像系統拍照。