[發明專利]一種浮游植物群落結構的檢測方法

無效

• 申請號: 201010184785.4
• 申請日: 2010-05-28
• 公開（公告）號: CN101838700A
• 公開（公告）日: 2010-09-22
• 發明（設計）人: 米鐵柱;孫靜;甄毓;于志剛
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;G01N27/447
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 吳蔭芳

技術領域：

本發明涉及海洋浮游植物種類和/或數量檢測的技術領域，特別涉及一種浮游植物群落結構的檢測方法。

背景技術：

浮游生物是一個在水體中營隨波逐流生活方式的獨特類群，易于在風和水流的作用下做被動運動，沒有或僅有微弱的游動能力；浮游生物包括浮游植物和浮游動物兩大類。浮游生物個體小，生活周期短，繁殖速度快，對環境的變化十分敏感，對水體的營養狀態的變化能夠迅速地做出反應。在水質好的水域，浮游生物的多樣性指數及均度指數均較大；反之，浮游生物的種類多樣性下降，分布呈現不均勻的情況。因此浮游生物群落結構特征的變化可作為指示生態環境變化的重要生物學參數。

赤潮浮游植物，是海水中某些微小的微型藻、原生動物或細菌在一定的環境條件下爆發性增殖或聚集在一起而引起水體變色的一種生態異常現象。在我國海域中，赤潮發生的區域分布很不均勻，浙江沿海及長江口臨近海域的赤潮災害最為嚴重，此外發生赤潮比較集中的海區還有渤海、福建沿海、珠江口海域等地。1998年春季，珠江口海域發生一次特大面積米氏凱倫藻赤潮，所影響到的海區養殖魚類幾乎全部死亡，造成了珠江口海域三地(深圳、珠海和香港)水產養殖業損失逾4億元之多；2000年長江口海域發生大面積具齒原甲藻赤潮，危害面積達7000平方千米，2004年5月東海長江口海域發生大規模東海原甲藻赤潮，面積達10000平方千米，世界罕見。近年來，近海海域赤潮更加肆虐，赤潮的爆發越來越頻繁，且涉及的范圍也越發廣泛。赤潮嚴重破壞了海洋生態平衡，給漁業及旅游業等造成了巨大的損失。除此之外，有些赤潮生物體內或代謝產物中含有生物毒素，通過食物鏈富集，會嚴重危害人類的健康。

因此，研究浮游植物赤潮的爆發機制，探索預警、預報乃至防治赤潮的方法已成為一個極具挑戰性的課題，其中浮游植物群落結構的檢測顯得尤為重要。

發明內容：

本發明所要解決的技術問題在于，將變性梯度凝膠電泳(DGGE)技術運用到微藻的鑒定中，并運用該技術對浮游植物多樣性進行研究，分析多樣性組成與環境因子的關系。

為了實現上述目的，本發明提供了一種浮游植物群落結構的檢測方法，其中，包括以下步驟：

a、浮游植物水樣采集

b、DNA的提取

c、PCR及瓊脂糖電泳檢測

d、使用變性梯度凝膠電泳技術進行浮游植物群落結構分析

e、圖形處理

f、數據分析。

所述步驟a為：浮游植物水樣首先用200目的篩絹過濾，然后將過濾后的海水用0.45μm孔徑的硝酸纖維素膜過濾，將濾膜轉移至2ml?Eppendorf管中，置于-20℃，用于浮游植物群落多樣性的分析。

所述步驟b為：

(1)收集和洗滌藻細胞：在收集的藻細胞中中加入750μl?TE緩沖液洗滌藻細胞，10000rpm?4℃離心10分鐘，小心棄上清；加入250μl?TE緩沖液懸浮藻細胞；

(2)裂解藻細胞：加入500μl預熱55℃的抽提緩沖液，混和均勻，放入55℃水浴中一小時，直到藻液呈透明狀；放進4℃冰箱冷卻3分鐘；

(3)抽提：加入1ml氯仿∶異戊醇(24∶1)，輕柔顛倒，使之呈乳濁液；14000rpm?4℃離心10分鐘，小心用微量吸頭取出上清液(約600μl)至eppendorf管中，重復抽提一次；

(4)沉淀：加二倍體積的冰冷的無水乙醇和1/10體積的NaAc，混勻，放入-80℃冰箱30分鐘；14000rpm?4℃離心10分鐘，小心棄上清；

(5)洗滌：DNA沉淀用預冷的70％酒精洗兩次；

(6)溶解：自然風干，溶于20-40μl?TE緩沖液中，置于-20℃待用

所述步驟c中PCR進行擴增所使用的引物為：

FP-5’CGCGCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCAGGTCTGTGATGCCC3’，RP-5’ACGGGCGGTGTGTRC3’，

所述PCR擴增所用引物或者為：

F?1427-5’CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGG3’，

R1616-5’GCGGTGTGTACAAAGGGCAGGG3’，

所述PCR反應體系(50ul)包括：

模板DNA，

200μM?dNTP，

1.5mM?MgCl2，

0.3μM引物，

2.5U?Ex?Taq?DNA?polymerase，