[發明專利]重組融合蛋白質在快速診斷檢測中的直接應用

無效

• 申請號: 201010184614.1
• 申請日: 2010-05-27
• 公開（公告）號: CN102262158A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發明（設計）人: 戴國禎;孫東旭
• 申請（專利權）人: 戴國禎;孫東旭
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;C12N15/62;C12N15/63;C07K19/00
• 代理公司: 徐州市淮海專利事務所 32205
• 代理人: 華德明

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體地說涉及直接采用攜帶融合標簽的整體融合蛋白質進行快速診斷檢測。

背景技術

檢測人類等生物樣本中特定蛋白質因子的含量，對于醫學、生物學、農牧業等領域的基礎研究和實際應用具有非常重要的意義。例如，檢測人體血液中針對丙型肝炎等致病病毒特異性抗體的存在，是目前診斷這些傳染病的主要手段。同樣，測定癌癥和心血管疾病的早期生物標記蛋白質因子含量的變化對于這些疾病的早發現早治療和療效觀察極為重要。隨著醫學和生物學領域的不斷進展，各種蛋白質檢測方法應運而生，其中最方便、應用范圍最廣也是目前使用最多的是各種免疫檢測技術，例如免疫沉淀、免疫組織化學、和酶聯免疫吸附檢測(Enzyme-Linked?ImmunoSorbent?Assay，簡稱ELISA)和快速免疫檢測技術等。雖然ELISA比較簡便常用，可以定量，但是耗時較長，一般需要4-5小時或者過夜，而且花費較高，需要特定的讀測儀器和受過專門訓練的工作人員才能完成。而實際工作中往往不具備這些檢測條件，或需要立即知道檢測結果，因此ELISA的廣泛應用受到很大限制。而近年來基于平面流動技術發展起來的快速免疫檢測方法，因其操作簡單、費用低、耗時短(僅需15-20分鐘就可以看到結果)，無論在國內外，在農村還是城市都比ELISA方法具備優勢和發展前景。基于此，世界衛生組織(WHO)于2005年提出采用快速檢測技術檢測禽流感等各類流行性感冒病毒。同時，美國疾病防治中心(CDC)也于2004年建議采用快速檢測技術對懷孕婦女和醫護工作人員普遍檢查人類免疫缺陷病毒(HIV)的感染情況。

快速免疫檢測主要有兩類方法。一類方法是檢測樣本中某一特異性抗原，例如檢測人體血液中的乙型肝炎病毒(HBV)核心抗原或表面抗原，這類方法需要親和力高、信號強、特異性好的相應抗體作為主要檢測試劑。另一類方法是檢測樣本(通常是血液)中針對某一抗原的特異性抗體，例如檢測人體血液中針對HIV或者丙型肝炎病毒(HCV)的抗體，這類方法需要純度高、溶解性好、信號強、特異性專一的相應抗原分子或抗原片段作為主要檢測試劑。圖1展示針對抗體的快速檢測試劑組件。以檢測人體血樣中HCV抗體為例，在加樣處加入血液樣品，通過擴散滲透作用經過玻璃纖維到達存放干燥的金標-抗原(本例為HCV核心蛋白)位置，使之溶解。如果血樣中存在抗HCV抗體，則這些抗體將與金標抗原結合，形成抗體-金標抗原復合物，繼續沿硝酸纖維膜向吸水紙方向移動。到達檢測線區域時，與檢測線上的固相抗原結合，其中的金標抗原在此處富集而顯示陽性反應信號。未結合的金標抗原在質控線區域被此處的固相HCV抗體捕獲而顯示質量控制信號。如果血樣中不含HCV抗體，則金標抗原不能在檢測線上富集顯色，但是能夠在質控線富集顯色而呈陰性反應(圖1)。

目前國內外針對抗體的快速檢測方法和相應試劑普遍存在著檢測靈敏度較低的問題，無法有效地檢測抗體含量較低的血樣，這在我國國內產品中表現尤甚。以HCV抗體快速檢測試劑為例，國內一家公司產品對HCV陽性血樣的檢出率僅為22.5％。造成這一問題的主要原因有：(1)用來作為抗原的蛋白質通常在微生物蛋白質表達系統例如大腸桿菌中產生。由于改變了蛋白質表達的外部環境，許多本來水溶性蛋白質由于形成內含體(inclusion?body)等原因，在大腸桿菌中表達后水溶性很差，需要特殊的促溶性處理(比如用高濃度尿素溶解，或者用亞硝基胍使蛋白質變性后再復性)才能用作抗原；而這些促溶性處理除了增加成本、耗費時間、降低產量之外，還不可避免地導致抗原蛋白質產物的不均一性和分子構型及其識別相應抗體特性的改變。(2)實際工作中，用做抗原的蛋白質本身分子量可能很小，而且，為了規避非特異性結合，常常只表達抗原蛋白質的某一段序列(結構域)用作抗原。其分子量就更加小，進行膠體金標記時效果較差，使檢測信號微弱，即便有陽性反應，也因為信號過弱而觀察不到。

為了克服上述問題，人們提出了一些解決方法，比如通過選擇表達抗原蛋白質序列、嘗試各種途徑促進蛋白質水溶性、改變用于金標的膠體金顆粒大小、提高金標標記效率、采用生物素-鏈親和素(biotin-streptavidin)系統放大檢測信號等等。這些方法雖然有一定效果，然而，到目前為止，快速免疫檢測方法靈敏度低的問題仍然沒有得到根本改善。