[發(fā)明專利]5’-RACE接頭序列添加方法及接頭序列和5’端未知基因完整編碼序列的擴(kuò)增方法

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010184510.0
• 申請日: 2010-05-27
• 公開（公告）號: CN101864413A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱延明;柏錫;李勇;王希;紀(jì)巍;才華
• 申請（專利權(quán)）人: 東北農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/11
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標(biāo)事務(wù)所 23109
• 代理人: 何強(qiáng)

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種接頭序列添加方法及接頭序列和基因完整編碼序列的擴(kuò)增方法。

背景技術(shù)

若要克隆編碼區(qū)僅3’端一側(cè)的序列已知的基因，需要先獲得5’端一側(cè)的未知序列，進(jìn)而獲得完整的編碼序列。如今，RACE技術(shù)是根據(jù)基因已知的部分序列擴(kuò)增未知片段的最佳方法。RACE技術(shù)(rapid?amplification?of?cDNA?ends，RACE)概括地說就是通過逆轉(zhuǎn)錄和PCR的有機(jī)結(jié)合，擴(kuò)增基因未知片段的技術(shù)。利用基因編碼區(qū)3’端的已知序列，獲得5’端未知序列的技術(shù)稱為5’-RACE，是如今擴(kuò)增5’端未知基因完整編碼序列的最常用技術(shù)。

5’-RACE基本原理：首先獲得包含目的基因mRNA的RNA樣品，并利用基因特異的引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得目的基因相應(yīng)的cDNA；在cDNA的3’末端(對應(yīng)mRNA序列5’末端)加上特定的序列，通常將這段添加在cDNA上的特定序列稱為接頭(adaptor)，同時(shí)合成與adaptor序列相匹配的引物，稱為錨定引物；然后利用基因已知序列設(shè)計(jì)基因特異性引物，與錨定引物配對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到未知部分的片段；再將擴(kuò)增得到的片段測序，即可獲得目的基因未知部分的序列。

目前按接頭序列的添加方法可分為3大類：末端轉(zhuǎn)移酶法(terminaldeoxynucleotidyl?transferase?method，TdT?method)、接頭連接法(adaptor?ligation)和寡核苷酸帽法(oligo?caping?method)。近年出現(xiàn)了一些可同時(shí)擴(kuò)增編碼區(qū)3’一側(cè)與5’一側(cè)未知片段的技術(shù)，并推出了相應(yīng)的試劑盒，如GeneRacer(Invitrogen公司)、SMART?RACE(Takara-BD公司)等。這些技術(shù)的基本原理是用oligo(dT)起始逆轉(zhuǎn)錄，在完整mRNA逆轉(zhuǎn)錄所得的完整cDNA產(chǎn)物的3’端及5’端分別添加3’-adaptor及5’-adaptor，使所有完整的cDNA在兩端都帶有adaptor，成為包含所有基因信息的通用模板。再利用目的基因的特異引物與某一端的錨定引物搭配，則可利用同一份通用模板獲得不同基因、不同末端的未知序列。

采用末端轉(zhuǎn)移酶法和接頭連接法存在一個(gè)共同的問題，就是會在逆轉(zhuǎn)錄所得的所有cDNA的3’末端都加上adaptor，無法區(qū)分5’端完整與不完整的mRNA，也無法區(qū)分逆轉(zhuǎn)錄進(jìn)行得完全與不完全的cDNA，因此不能保證mRNA5’末端信息的完整。這樣，若要獲得基因編碼區(qū)完整5’末端的信息，往往需要進(jìn)行不只一次的“逆轉(zhuǎn)錄-添加adaptor-PCR-測序”過程，每次需根據(jù)上一次測序所得的序列設(shè)計(jì)新的逆轉(zhuǎn)錄引物，也就是需要進(jìn)行多輪RACE。此外，這兩種方法都需要先將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行純化，才能添加adaptor，而cDNA在純化過程中會發(fā)生損失，因此需要制備較大量的cDNA。

雖然寡核苷酸帽法可以選擇性地對5’端完整的mRNA進(jìn)行擴(kuò)增，解決了末端轉(zhuǎn)移酶法和接頭連接法對mRNA完整性無選擇性的問題。但寡核苷酸帽法存在需要對RNA進(jìn)行多步操作，在各步的酶反應(yīng)之間又都需要對RNA進(jìn)行純化，而且RNA很容易被降解，因此很容易損失掉大量的RNA，從而降低了此后RACE工作的效率，對于豐度較低的mRNA，甚至很難得到擴(kuò)增產(chǎn)物。

利用通用模板作為起始材料，雖然可高通量地進(jìn)行基因克隆，但是若僅需要通過5’-RACE擴(kuò)增少數(shù)5’端未知基因編碼區(qū)的未知片段，通用模板并不適合。原因有如下2點(diǎn)：

首先，通用模板的復(fù)雜性很高。通用模板對基因沒有選擇性，所有基因的完整cDNA均添加有adaptor，理論上包含所有基因?qū)?yīng)的cDNA。在復(fù)雜的模板中，目的基因cDNA含量相對較低，對于表達(dá)豐度較低的基因，克隆難度則更大。而且，模板越復(fù)雜，PCR反應(yīng)中越容易發(fā)生非特異擴(kuò)增，影響目的片段在PCR反應(yīng)中的擴(kuò)增效率，非特異的擴(kuò)增產(chǎn)物還會干擾目的條帶的選擇。

其次，通用模板制備過程中，信息損失的可能性較大。這是因?yàn)椋ㄓ媚０鍖NA以及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的完整性要求都很高，不完整mRNA的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以及逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)中鏈延伸不完全的cDNA都不會被添加adaptor；而逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的鏈延伸過程又很容易發(fā)生未成熟終止，若待延伸的mRNA模板較長，或具有較復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)，則未成熟終止的可能性較大。制備通用模板時(shí)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)需要從mRNA的3’末端一直延伸到5’末端，對于編碼區(qū)較長的基因，很難得到基因的完整cDNA。這些都會增加5’-RACE的工作量，并可能影響5’-RACE結(jié)果。