[發明專利]5’-RACE接頭序列添加方法及接頭序列和5’端未知基因完整編碼序列的擴增方法

無效

• 申請號: 201010184510.0
• 申請日: 2010-05-27
• 公開（公告）號: CN101864413A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發明（設計）人: 朱延明;柏錫;李勇;王希;紀巍;才華
• 申請（專利權）人: 東北農業大學
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/11
• 代理公司: 哈爾濱市松花江專利商標事務所 23109
• 代理人: 何強

1.5’-RACE接頭序列添加方法，其特征在于5’-RACE接頭序列按以下步驟添加：

一、根據目的基因設計目的基因特異性逆轉錄引物，根據目的基因所在物種基因組特征設計接頭序列，接頭序列的3’末端設計有至少3個連續的鳥嘌呤；

二、在逆轉錄體系中加入接頭和目的基因特異性逆轉錄引物，然后用有末端轉移酶活性的逆轉錄酶進行逆轉錄，實現了5’-RACE接頭序列添加。

2.根據權利要求1所述的5’-RACE接頭序列添加方法，其特征在于步驟一所設計的目的基因特異性逆轉錄引物與mRNA的結合位點與該目的基因cDNA3’端接近。

3.根據權利要求1所述的5’-RACE接頭序列添加方法，其特征在于步驟一所設計的接頭序列的3’末端設計有3個、4個、5個、6個、7個或8個連續的鳥嘌呤。

4.接頭序列，適用于野生大豆(Glycine?soja)的5’-RACE接頭序列，其特征在于該5’-RACE??接頭序列為5’-ATAGCAGTGTGATACCATGAGACGGGCACATTACGGCTCGGGG-3’。

5.5’端未知基因完整編碼序列的擴增方法，其特征在于5’端未知基因完整編碼序列按以下步驟進行擴增：

一、根據目的基因及目的物種設計目的基因特異性逆轉錄引物、目的基因特異性巢式PCR引物以及接頭序列，并根據接頭序列設計巢式錨定引物，接頭序列的3’末端設計有至少3個連續的鳥嘌呤；

二、在逆轉錄體系中加入接頭和目的基因特異性逆轉錄引物，然后用有末端轉移酶活性的逆轉錄酶進行逆轉錄，獲得3’端添加了接頭序列的單鏈cDNA片段；

三、以3’端添加了接頭的單鏈cDNA片段為模板，用目的基因特異性巢式PCR引物和巢式錨定引物進行巢式PCR擴增；

四、對步驟三獲得的巢式PCR擴增片段進行測序，再利用軟件分析，獲得目的基因3’末端至5’末端的序列，驗證后即得到5’端未知目的基因的完整編碼序列；其中步驟一所設計的巢式錨定引物在目的基因所在的物種基因組或cDNA中無可見非特異擴增產物。

6.根據權利要求5所述的基因完整編碼序列的擴增方法，其特征在于步驟一所設計的目的基因特異性的巢式PCR引物與cDNA的結合位點與該目的基因cDNA3’端接近。

7.根據權利要求5所述的基因完整編碼序列的擴增方法，其特征在于步驟一所設計的接頭序列長度大于40bp。

8.根據權利要求5、6或7所述的基因完整編碼序列的擴增方法，其特征在于步驟一所設計的巢式錨定引物為2～10條；步驟一所設計的目的基因特異性巢式PCR引物為2～4條。

9.根據權利要求8所述的基因完整編碼序列的擴增方法，其特征在于步驟一所設計的目的基因特異性巢式PCR引物之間的Tm值相差小于1℃。

10.根據權利要求5、6、7或9所述的基因完整編碼序列的擴增方法，其特征在于步驟四中驗證采用以下步驟：將步驟三巢式PCR擴增片段的測序結果與目的基因中已知序列進行拼接，然后將拼接得到的序列進行比對和完整性分析，再在拼接所得序列兩端設計引物，通過PCR確認拼接結果。