[發明專利]一種多重連接與延伸依賴的探針擴增方法及其試劑盒

無效

• 申請號: 201010183920.3
• 申請日: 2010-05-25
• 公開（公告）號: CN101845502A
• 公開（公告）日: 2010-09-29
• 發明（設計）人: 陶炯;孫維;陳煒;周華
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院附屬新華醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海智信專利代理有限公司 31002
• 代理人: 薛琦

【技術領域】

本發明涉及一種擴增方法，具體地說，是關于一種多重連接與延伸依賴的探針擴增方法及其試劑盒。

【背景技術】

目前，多重連接依賴的探針擴增技術(Multiplex?Ligation?dependent?ProbeAmplification，MLPA)是一項在科研與臨床檢驗中廣泛使用的中等通量的檢測多個DNA位點的分子生物學技術。整體而言，MLPA是一種多重PCR的技術。能夠同時探查多達50個基因組DNA位點的拷貝數目異常，最少甚至能區分一個核苷酸的序列差異。MLPA在反應中，設置50對左右的探針，每對探針特異性的檢測一段靶序列，經過一次PCR反應，同時檢測所有探針的劑量，并進而檢測不同探針所對應靶序列的劑量(或拷貝數)。

與常規多重PCR不同，MLPA反應過程中，擴增的并不是靶序列，而是那些與靶序列復性雜交并被連接的探針。相對于常規的多重PCR，MLPA反應的PCR步驟僅需要一對通用引物。MLPA擴增的產物長度從100bp至500bp不等，可通過毛細管電泳進行區分。同時通過電泳結果中，不同條帶的片段長度與峰值，可以判斷出相應探針對應的檢測位點的拷貝數變化。

MLPA整個試驗過稱可被分為5個步驟：1)DNA變性并與MLPA探針進行雜交；2)連接反應；3)PCR反應；4)PCR產物通過毛細管電泳分離；5)電泳結果進行數據處理。

MLPA針對每一個靶序列設計一對寡核苷酸探針，分別稱為左、右探針。左探針的5’端為通用引物X，3’端為其與靶序列的雜交區。右探針的5’端為其與靶序列的雜交區，3’端為通用引物Y的互補區。左、右探針的雜交區在靶序列上緊密相連，而MLPA使用的連接酶只能連接雜交在同一序列并緊密相連的兩段序列，因此，只有當相應的左右探針都正確雜交到相應的靶序列區時，連接反應中左右探針才能被連接。通用引物區與雜交區間可插入填充序列以調節探針序列總長。MLPA針對不同的靶序列設計的探針其雜交區與填充序列不同，但是都攜帶相同的通用引物區X與Y。通過填充序列的選擇和調整，可使得不同的探針對總長各不相同，這樣在后續的毛細管電泳中能根據長度不同進行分離。

在MLPA反應中，首先，模板DNA變性，并與MLPA探針混合孵育雜交過夜。在這個過程中，相應的探針與靶序列復性雜交。雜交完成后，加入連接酶，只有正確雜交的左右探針才能被連接。在接下來的PCR過程中，加入熒光標記的通用引物X、未加熒光標記的通用引物Y以及DNA多聚酶，那些未連接的探針因為只含一個通用引物區，在PCR過程中不能被擴增，也不會含有相應的熒光信號，而只有連接的探針才能夠被擴增，所以探針連接產物的數量與模板DNA中靶序列的數量對應成正比。PCR擴增產物通過毛細管電泳分離。

這樣，在一次MLPA反應中，可有多達50個靶序列被檢測，用相關軟件分析電泳結果，可知不同探針所檢測的靶序列的缺失，擴增及拷貝數異常。MLPA作為一項簡單、實用、穩定的中等通量DNA檢測技術，被廣泛應用于臨床與科研中。

但是，由于MLPA技術的原理特點，MLPA技術僅能用于檢測保守的、不具有多態性的DNA位點，并不能用于檢測具有長度多態性的DNA位點，如短串聯重復序列位點(short?tandem?repeats，STR)，這使得MLPA技術的進一步應用受到限制。同時，由于MLPA技術的探針中需要插入填充序列，在探針制作時，需要使用M13噬菌體培養，費時、復雜且成本較高。

STR廣泛存在于人類和其他生物體基因組中。其核心序列一般為2-6bp，核心序列重復次數的不同形成了豐富的遺傳多態性。由于STR遺傳標記數量眾多，雜合度高，特異且穩定，使得其成為目前遺傳學分析最重要的遺傳標記之一，被廣泛應用于重組作圖，群體遺傳學和連鎖分析中。盡管STR位點的應用如此廣泛，目前其主要檢測方法仍為單一STR位點的PCR檢測，費時費力。由于STR存在重復序列，擴增相對較為困難，因此，目前尚沒有一種技術能夠靈活地針對多個STR位點進行分型。如果能夠開發一種簡單，快速，靈活的中等通量的STR分型檢測技術，其應用前景將會非常廣闊。

【發明內容】

本發明的目的是針對現有技術中的不足，提供一種多重連接與延伸依賴的探針擴增方法。

本發明的再一的目的是，提供一種能夠同時擴增與檢測多個DNA位點試劑盒。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案是：

一種多重連接與延伸依賴的探針擴增方法，所述的方法包括如下步驟：

(1)DNA靶序列變性并與MLEPA探針進行雜交；

(2)延伸與連接反應；