[發(fā)明專利]基于綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白的雙熒光共定位系統(tǒng)

無效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201010183669.0
• 申請日: 2010-05-25
• 公開（公告）號: CN101863983A
• 公開（公告）日: 2010-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 林堅;夏斌;周軍
• 申請（專利權(quán)）人: 北京大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/62;C12N15/63;C12N1/15;C12N1/19;C12N1/21;C12N5/10;C12Q1/02;G01N21/64
• 代理公司: 北京紀凱知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11245
• 代理人: 關(guān)暢;任鳳華

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于綠色熒光蛋白和紅色熒光蛋白的雙熒光共定位系統(tǒng)。

背景技術(shù)

研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)間的相互作用(PPI)是研究細胞中信號通道和傳導(dǎo)的基礎(chǔ)。細胞內(nèi)部的動態(tài)和平衡態(tài)、內(nèi)部變化和細胞生理功能都很大程度上依賴于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的信號網(wǎng)絡(luò)進行調(diào)節(jié)。檢測他們之間的相互作用，揭示生物學功能是目前生物醫(yī)藥領(lǐng)域的熱點之一。

通過分子生物學的方法，調(diào)節(jié)特定的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用為一些疑難雜癥也提供了一種新的治療方法的可能性。因此，無論是學術(shù)科研機構(gòu)還是制藥公司對這一領(lǐng)域都表現(xiàn)出濃厚的興趣，希望通過發(fā)現(xiàn)和調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)的相互作用作，為臨床治療找到一種新的治療手段。

在生物體外有很多種研究蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的方法。其中大多需要首先將這些蛋白從其生理環(huán)境中純化出來才可以使用。因為只有將所研究的蛋白還原到自然細胞生理狀態(tài)下進行研究，我們才能得到準確空間信息，因此能夠用于活細胞中生理水平PPI的分析技術(shù)顯得尤為重要。

類似的技術(shù)包括：熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(FRET)、雙分子熒光互補技術(shù)(BiFC)、熒光互相關(guān)譜(FCCS)等。在這些方法中，雙色熒光共定位技術(shù)是較為普遍的研究蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)之一，并且廣泛用于研究各類細胞和生物中。另外，亞細胞定位、多蛋白質(zhì)分析同樣也能夠被雙色熒光共定位技術(shù)檢測出來。

綠色熒光蛋白GFP和紅色熒光蛋白RFP蛋白，是自發(fā)熒光蛋白中最重要的成員。它們分別是從水母victoria和珊瑚Discosma中分離得到的自發(fā)熒光蛋白。它們的光譜范圍分別是359nm-509nm和558nm-702nm。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的一個目的是提供一種用于檢測待測蛋白是否相互作用的融合蛋白組。

本發(fā)明所提供的用于檢測待測蛋白是否相互作用的融合蛋白組，為如下1)和2)：

1)由熒光蛋白A、待測蛋白A和核輸出信號組成的融合蛋白；

2)由熒光蛋白B、待測蛋白B和核定位信號組成的融合蛋白；

所述熒光蛋白A與所述熒光蛋白B為發(fā)不同顏色熒光的熒光蛋白；

所述1)所示融合蛋白片段與2)所示融合蛋白片段分別獨立包裝；

所述待測蛋白A和待測蛋白B是待檢測是否相互作用的兩個蛋白。

上述融合蛋白組中，所述1)所示融合蛋白中，熒光蛋白A、待測蛋白A和核輸出信號順次連接；

所述2)所示融合蛋白中，待測蛋白B、核定位信號和熒光蛋白B順次連接。

上述融合蛋白組中，所述熒光蛋白A為紅色熒光蛋白或綠色熒光蛋白；所述熒光蛋白B為紅色熒光蛋白或綠色熒光蛋白。

上述融合蛋白組中，所述綠色熒光蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；所述紅色熒光蛋白的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：3所示；所述核輸出信號的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：5所示；所述核定位信號的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：7所示。

上述任一所述1)所示融合蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍；上述任一所述2)所示融合蛋白的編碼基因也屬于本發(fā)明的保護范圍。

如下Ⅰ、Ⅱ或Ⅲ所示的重組表達載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或表達盒也屬于本發(fā)明的保護范圍：

Ⅰ、含有上述任一所述1)所示融合蛋白的編碼基因的重組表達載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或表達盒；

Ⅱ、含有上述任一所述2)所示融合蛋白的編碼基因的重組表達載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或表達盒；

Ⅲ、含有上述任一所述1)所示融合蛋白的編碼基因和上述任一所述2)所示融合蛋白的編碼基因的重組表達載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或表達盒。

上述重組表達載體、重組菌、轉(zhuǎn)基因細胞系或表達盒中，所述Ⅰ中所述重組表達載體為如下a所示；所述Ⅱ中所述重組表達載體為如下b所示；所述Ⅲ中所述轉(zhuǎn)基因細胞系是將a所示重組表達載體和b所示重組表達載體轉(zhuǎn)入細胞得到的；

a、按照如下方法得到的重組表達載體：在載體pmWasabi-C的多克隆位點間插入所述核輸出信號的編碼基因和待測蛋白A的編碼基因，使綠色熒光蛋白的編碼基因、待測蛋白A的編碼基因和核輸出信號的編碼基因順次連接為融合基因；

b、按照如下方法得到的重組表達載體：在載體pDsRed1-N1的多克隆位點間插入所述核定位信號的編碼基因和待測蛋白B的編碼基因，使待測蛋白B的編碼基因、核定位信號的編碼基因和紅色熒光蛋白的編碼基因順次連接為融合基因。

上述轉(zhuǎn)基因細胞系中，所述宿主細胞為Hela細胞系。