[發明專利]一種檢測常見耳聾突變基因的方法

無效

• 申請號: 201010183359.9
• 申請日: 2010-05-26
• 公開（公告）號: CN102260732A
• 公開（公告）日: 2011-11-30
• 發明（設計）人: 馮永;鄔玲仟
• 申請（專利權）人: 湖南家輝生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 長沙正奇專利事務所有限責任公司 43113
• 代理人: 盧宏

技術領域

本發明涉及一種檢測常見耳聾突變基因的方法，具體地是檢測GJB2、SLC?26A4、線粒體基因突變的方法。

背景技術

CAPs(cleaved?amplification?polymorphism?sequence-tagged?sites)CAPs技術又稱為PCR-RFLP。是用特異設計的PCR引物擴增目標材料時，由于特定位點的堿基突變、插入或缺失數很少，以至無多態出現，往往需要對相應PCR擴增片段進行酶切處理，以檢測其多態性。CAPs標記在二倍體植物研究中可發揮巨大的作用，是PCR標記的有力補充。但在多倍體植物中的應用有一定的局限性。另外，CAPs標記需使用內切酶，這又增加了研究成本，限制了該技術的廣泛應用。PCR-RFLP的基本原理是用PCR擴增目的DNA，擴增產物再用特異性內切酶消化切割成不同大小片段，直接在凝膠電泳上分辨。不同等位基因的限制性酶切位點分布不同，產生不同長度的DNA片段條帶。此項技術大大提高了目的DNA的含量和相對特異性，而且方法簡便，分型時間短。

現有技術研究表明：中國聾人常見耳聾突變的發生頻率，確定了GJB2、SLC?26A4、線粒體基因(A1555G和C?1494T突變)是導致中國大部分遺傳性耳聾發生的3個最為常見的基因，對以上基因進行檢測可以診斷近60％的遺傳性耳聾，為在我國進行耳聾基因診斷奠定了堅實的理論基礎。其中，GJB2在遺傳性非綜合征型耳聾(NSHI)中所占比例相對較高，占所有NSHI?50％左右，235deIC則是東亞人群發病率最高的突變；SLC26A4基因突變以IVS7-2A＞G為最常見；線粒體突變所致耳聾亦較常見，約占語前聾的5％，且絕大部分系1555A＞G突變。

目前基于遺傳性耳聾基因篩查的試劑盒有多種方法，如基因芯片技術，但價格較高，難于普及。

發明內容

本發明的目的是提供一種能同時檢測GJB2、SLC?26A4、線粒體基(A1555G和C?1494T突變)的方法，可以應用于培養和未培養羊水、絨毛、臍帶血，外周血等其他的組織抽提出的gDNA，快速準確地進行常見耳聾突變熱點的產前診斷/篩查。

本發明提供的檢測GJB2、SLC?26A4、線粒體基因A1555G和C?1494T突變的方法包括如下步驟：

(1)根據GJB2、SLC?26A4、線粒體基因A1555G和C?1494T突變位點的DNA序列，設計相應的引物；

(2)采樣后提取樣品中的用多重PCR擴增三個耳聾基因的三個片段；

(3)PAGE膠或瓊脂糖膠檢測，當目的片段產量和特異性都很好時，可行酶切；分別用限制性內切酶Apal、ECO521和Alw26l酶切步驟(2)中的三個片段；

(4)酶切產物再次PAGE膠檢測；

其中多重PCR擴增的步驟和條件是：

①模板DNA的變性：模板DNA經加熱至95℃左右5分鐘后，使模板DNA雙鏈解離，使之成為單鏈，以便它與引物結合，為下輪反應作準備；

②模板DNA與引物的退火(復性)：模板DNA經加熱變性成單鏈后，溫度降至61℃左右，引物與模板DNA單鏈的互補序列配對結合；

③引物的延伸：DNA模板--引物結合物在70℃條件下在DNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應原料，靶序列為模板，按堿基配對與半保留復制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補的半保留復制鏈重復循環變性--退火--延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復制鏈”。

具體如圖2：

根據已知的基因序列來設計相應的引物是本領域技術人員能夠實現的，并且已經有根據引物序列提供商業上的引物合成服務。

對于酶切產物的PAGE膠檢測，也是現有技術中已知的技術，具體參見《分子生物學》蛋白質電泳檢測常用技術。

本發明人，通過研究發現在同一條件下，三個突變位點片斷的擴增條件，使得三個突變位點均能同時被靈敏地檢出。本發明方法成本低廉，反應快速，易于推廣，可以應用于培養和未培養羊水、絨毛、臍帶血，外周血等其他的組織抽提出的gDNA，快速準確地進行常見耳聾突變熱點的產前診斷/篩查。

附圖說明

圖1是本發明實施例酶切后的PAGE膠檢測結果；

圖2是多重PCR擴增的步驟圖。

具體實施方式

本發明根據GJB2.SLC26A4.mtDNA12sRNA基因中突變位點，設計了三對引物，引物的序列見下表