[發明專利]蛋白酶激活受體激動劑的制備方法及其用途

無效

• 申請號: 201010183337.2
• 申請日: 2010-05-26
• 公開（公告）號: CN101870974A
• 公開（公告）日: 2010-10-27
• 發明（設計）人: 張云;張勇;李文輝;余果宇;江萍;王嚴戒
• 申請（專利權）人: 中國科學院昆明動物研究所
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C12N15/70;C07K7/06;C12Q1/68;G01N33/53;G01N21/64;A61K38/08;A61P17/02;A61P35/00;A61P7/04
• 代理公司: 昆明祥和知識產權代理有限公司 53114
• 代理人: 孟蓉英

技術領域

本發明涉及蛋白酶激活受體激動劑的制備方法及其用途，即三葉因子(trefoil?factor，TFFs)及其衍生結構作為蛋白酶激活受體(protease-activated?receptors，PARs)的激動劑在細胞遷移及創傷修復制藥中的應用；本發明同時提供三葉因子和蛋白酶激活受體表達變異在臨床胃腸道腫瘤疾病檢測中的應用，屬生物醫學領域。

背景技術

蛋白酶激活受體(protease-activated?receptor，PAR)屬于單鏈七次跨膜的G蛋白偶聯受體(GPCR)家族。目前為止，一共有四種PAR亞型被發現，分別是PAR1、PAR2、PAR3和PAR4，除了PAR2為胰蛋白酶激活受體外，其他三個都是凝血酶的受體。在不同細胞類群中，PAR受體的表達存在差異，如人血小板僅表達PAR1和PAR4，胃癌細胞株AGS本身不表達PAR4，而HT-29細胞株則表達PAR1、PAR2和PAR4。PAR受體在血液循環系統、呼吸系統、神經系統和消化系統中都發揮了重要的功能，與心血管疾病、癌癥、神經退行性疾病等密切相關。凝血酶受體1(PAR1)參與正常的血小板聚集過程，PAR1激動劑可誘導人血小板聚集，涉及Ca²⁺動員和促凝活性的增強，可用于止血藥物的開發。蛋白酶受體在神經元和星形膠質細胞的存活中具有重要的作用，特別是涉及到損傷和炎癥中神經元的功能。PAR1激動劑可極大地保護星形膠質細胞和海馬神經元，避免包括低血糖癥和氧化應急環境刺激引起的死亡。PAR1激活可引起身體鎮痛，其激動劑可望用于鎮痛藥物的開發。霧化劑給予PAR4激動劑可抑制5-羥色胺(5-HT)誘導的支氣管痙攣，抑制組氨誘導的氣道阻力增加，目前PAR4激動劑正進行治療哮喘藥物的開發。PAR1在損傷修復中起作用，PAR1激活劑局部應用到損傷組織中可促進血管生成，具有促進損傷愈合的功能。總而言之，蛋白酶受體1和4的激動劑在制藥中具有廣泛的應用前景。

細胞遷移是機體正常生長發育必不可缺的生理過程。組織修復再生、創傷修復的過程中離不開它。在上皮愈合的過程中，涉及細胞脫落和調亡，基質暴露，細胞和細胞間連接的解聚，細胞遷移和細胞連接的重構的過程。三葉因子(trefoil?factor，TFF)為一類含有一個或者多個三葉因子結構域的分泌型的蛋白質，三葉因子結構域由大約38～39個氨基酸殘基組成，含有6個半胱氨酸，以1-5，2-4，3-6的形式形成二硫鍵。人三葉因子含有三個成員，分別是三葉因子1(TFF1)、三葉因子2(TFF2)和三葉因子3(TFF3)。三葉因子1和三葉因子3只含有一個三葉因子結構域，而三葉因子2含有兩個三葉因子結構域。三葉因子廣泛地分布在胃腸道上皮及其他的上皮系統中，與粘膜保護，損傷修復和腫瘤抑制密切相關。三葉因子為潛在的腫瘤抑制因子。三葉因子1，2和3均能夠促進細胞遷移和傷口修復，在胃腸道粘膜的損傷修復中起到重要的作用。

腫瘤難以治愈的一個主要難題在于腫瘤細胞的惡性轉移。腫瘤細胞不斷地從一個器官/組織轉移到新的器官/組織，使其病變，壞死，最終威脅生命。胃腸道腫瘤是臨床上的常見病、多發病，嚴重威脅著人民的生命和健康。我國是世界上胃癌高發國家，全世界約35％的胃癌病例發生在中國，每年死于胃癌患者超過26萬例，占所有癌癥死亡的1/5，在我國，大腸癌發病率每年遞增4.2％，比全世界每年遞增2％還高一倍，我國結直腸癌患者死亡率居癌癥死亡的第五位。腫瘤的早期診斷和病程檢測是臨床治療的重要指標，對于疾病的治療和病人的預后非常重要。

發明內容

本發明的目的是提供蛋白酶激活受體激動劑的制備方法及其用途，即兩棲類三葉因子Bm-TFF2和人三葉因子2及它們的衍生結構作為蛋白酶激活受體的激動劑在細胞遷移及創傷修復制藥中的應用，人三葉因子2和蛋白酶激活受體4表達變異在臨床胃腸道腫瘤疾病檢測中的應用，可用于生物醫學試劑制備，制藥和臨床檢驗等領域。

本發明的蛋白酶激活受體激動劑的制備方法包括：蛋白酶激活受體激動劑的制備方法包括：1)該激動劑是兩棲類物種大蹼鈴蟾的三葉因子Bm-TFF2、人三葉因子2；2)利用PCR技術獲取所需的Bm-TFF2或人三葉因子2基因全序列并將它們分別插入原核表達載體pET-32a(+)中；3)在大腸桿菌原核表達系統中高效表達了Bm-TFF2以及人三葉因子2；4)通過對表達菌株裂解液親和層析得到可溶性融合蛋白TRX-Bm-TFF2以及人三葉因子2；5)融合蛋白經第X因子蛋白酶酶切后再經鎳親和柱純化，得到純化的Bm-TFF2以及人三葉因子2。